青花菜中矿质元素的近红外光谱快速测定

雷雨梦，闫国超，杨 静，朱祝军

(浙江农林大学 园艺科学学院，浙江 杭州 311300)

青花菜(L.var.)又称西兰花、绿菜花、木立花椰菜等，是十字花科芸薹属植物，因其营养丰富、适宜冷冻贮运，在人们物质生活水平逐步提升的背景下，已逐渐成为人们日常消费的主要蔬菜之一。现代营养医学研究表明，矿质元素对人体具有重要的生理作用，如钙和磷对于骨骼和牙齿健康至关重要，但是人体自身无法合成矿质元素，需要从日常食物当中获取。蔬菜是人体矿质元素的主要来源之一，青花菜中含有丰富的镁(Mg)、钾(K)、钙(Ca)、磷(P)、铁(Fe)等矿质元素，提升青花菜矿质元素含量也是青花菜品质提升育种的重要目标。但在青花菜品质评价与品种选育的过程中，传统的矿质元素含量测定方法由于耗时费力，且昂贵复杂，不适于大批量样品的测定。因此，探索高效、便捷的青花菜矿质元素含量测定方法，对于青花菜养分评价、选择育种材料等具有重要意义。

近红外光谱(near infrared reflectance spectroscopy，NIRS)分析技术可通过测定近红外吸收光谱，同时分析样品中多种成分。NIRS作为获取信息的一种有效载体，是由于不同有机物含有不同基团，主要反映C-H、C-C、C=C、C-N和O-H等化学键的光谱特征，因此不同有机成分的样品具有不同的近红外光谱。依靠矿物元素与有机官能团或有机基质之间的联系，可通过光谱特征快速分析样品中矿物元素的含量。在对研究的元素进行校准之后，NIRS可在约1 min内对元素进行较为准确的定量估计，不仅不需使用化学试剂，而且极大地简化了样品制备过程，因此，在快速分析大批量样品元素含量方面具有较大潜力。目前，Galvez-sola等建立了NIRS快速测定柑橘叶片中N、K、Ca、Mg、B、Fe、Cu、Mn和Zn含量的技术方法；Escuredo等针对蜂蜜花源的识别，建立了基于NIRS的蜂蜜主要花粉类型及其矿物质组成(K、Ca、Mg、P)预测模型；Costa等利用NIRS结合偏最小二乘法(PLS)量化了必须元素Ca、Mg、Zn、P和K；Manuelian等利用NIRS (866～2 530 nm)预测了新鲜奶酪的主要矿质元素含量。以上结果表明，NIRS对不同样品中不同矿质元素含量检测具有一定潜力。

目前，已有青花菜硫苷含量的NIRS快速检测模型相关研究的报道，但尚无矿质元素方面的应用。本研究将电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)获得的青花菜样品矿质元素含量分析数据与NIRS光谱数据相结合，建立青花菜矿物元素含量的NIRS快速评价方法，以探讨NIRS法在大量和微量矿质元素方面的适用性，为其进一步推广应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与处理方法

试验所用青花菜材料由浙江省农业科学院与台州市农业科学研究院提供，共计120个不同种类的成熟青花菜样品。将青花菜花球切成大块，经液氮预冷后，用真空冷冻干燥机将样品冷冻干燥(72 h)。冻干后，将样品磨碎、过筛(100目)，低温(-40 ℃)保存，待用。

1.2 主要仪器

德国GANNA1-16LSC型号的冻干机，美国TJA公司的IRIS/AP型端视全谱直读ICP-OES光谱仪，美国CEM公司的MARS 5型微波消煮炉，美国Thermo Fisher Scientific公司Antaris II型号的NIRS分析仪。

1.3 试验方法

1.3.1 矿质元素含量测定

参考石元值等的方法，采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)测定青花菜中各元素含量。精确称取0.5 g冻干样品粉末(精确至0.001 g)于聚四氟乙烯高压微波消解罐中，加入10 mL浓硝酸后加盖密封，放入微波消解仪，同时使用10 mL硝酸作为空白对照。根据GB 5009.268—2016设定工作程序进行消解，结束后将消解管移至通风柜，先挥发多余硝酸，再用超纯水润洗消解管并将消解液定容至50 mL，即为待测样品溶液。

提前配置好各元素的标准溶液，采用ICP-OES光谱仪测得相应的强度响应值。以被测元素浓度为横坐标、分析公共线的强度响应值为纵坐标，绘制标准曲线。同时，采用ICP-OES法分析各样品和空白对照溶液中各元素响应值，根据标准曲线计算含量后按以下公式计算青花菜样品中的元素含量。

=(-)××。

式中：代表青花菜样品中待测元素的含量，单位为mg·g或mg·mL；为样品溶液中待测元素的质量体积分数，单位为mg·L；为试样空白溶液中被测元素质量体积分数，单位为mg·L；为试样消解液的定容体积，单位为mL；为试样稀释倍数；为试样称取质量或移取体积，单位为g或mL。

1.3.2 近红外光谱仪分析

近红外仪器开机预热30 min，光谱和噪声诊断通过后，进行样品扫描。首先在近红外仪器上建立工作流程，参数设置为：波长范围1 000～2 500 nm，分辨率8 cm，每次扫描中光谱自动扫描32次，取平均值作为最终光谱。然后将粉末样品放入与近红外仪匹配的5 cm盛样杯，进行光谱采集。预先用近红外光谱分析仪扫描青花菜的粉样，保持实验室环境温度为(26±2)℃，湿度为60%±20%。以内置背景为参照采集2个光谱，以减少样本加载误差。

将通过ICP-OES法分析得到的青花菜矿质元素含量数据输入仪器配套的化学计量软件，进行光谱分析处理。在PLS分析的基础上，采用不同的散射处理方式[多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)和标准正态变量变换(standard normal variate transformation，SNV)]，以及不同导数处理方式[一阶导数(FD)和二阶导数(SD)]对光谱进行预处理，得到校正模型和预测模型。再通过校正相关系数(coefficient of determination in calibration，RSQ)、验证相关系数(coefficient of determination in valibration，)、校正偏差(standard error of calibration，SEC)、验证偏差(standard error of predication，SEP)、相对分析误差(residual predictive deviation，RPD)对模型进行评估。利用配套的TQ Aanlyst II分析软件对光谱数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 青花菜品种资源矿质元素组成和含量

试验所用青花菜材料品种类型多样，种类丰富，具有广泛代表性。株型有直立和半直立型、主球和分枝型，生育期有早熟、中熟和晚熟，花蕾有细粒、中粒和粗粒，花球有紧实型和松散型。表1为ICP-OES测定的青花菜样品中矿质元素的平均值、浓度范围和标准偏差。该数据将用作“真实”元素浓度，用于评估光谱数据中模型估计的准确性。为确保模型效果，本研究根据惯例要求将研究元素估计值介于相同的范围，且真实值含量在近红外检测范围内。针对K、S、P、C、Fe、Mg 6种在植株中分布广泛、具有代表性的矿质元素，将验证集的含量包含于校正集中，以符合建立模型的要求。

表1 青花菜样品中各元素的含量Table 1 Contents of elements in broccoli samples mg·g-1

2.2 青花菜近红外光谱分析

一般情况下，通过近红外光谱仪扫描获得的光谱数据除光谱样品的自身信息外，还包含大量无关信息和噪声。为去除干扰，采用不同散射处理方式和导数处理方式对原始光谱进行预处理，以减弱甚至消除各种非目标因素对光谱的影响，净化谱图信息，为校正模型的建立奠定基础，主要包括Savitzky-Golay卷积平滑处理、导数处理、光谱散射处理，通过Savitzky-Golay卷积平滑(6点平滑)光谱曲线，解决相邻波段信息一致性导致的数据冗余问题；通过导数处理提高光谱的分辨率，减小基线漂移，消除光谱的谱峰重叠，在实际分析中一般采用FD和SD来进行光谱预处理；通过MSC和SNV消除固体颗粒物大小、表面散射，以及光程变化对NIR漫反射光谱的影响。

图1为青花菜样品经近红外光谱分析仪得到的近红外原始光谱，横坐标为光谱波长，范围为1 000～2 500 nm；纵坐标为青花菜样品吸光度。青花菜样品在1 100～1 300 nm、1 400 ～1 600 nm、1 650～1 850 nm和1 900～2 050 nm有明显的吸收峰，且变化趋势基本相同，说明青花菜样品的吸光度与其化学成分含量之间存在相关性。图2为经过MSC+FD处理的光谱曲线图。与图1原始光谱相比，经处理过的光谱曲线起伏更加显著，吸收峰更多，一些原本平滑的部分也出现了吸收峰。图3为经过MSC+SD处理的光谱曲线图，出现明显的拟合现象。

图1 青花菜近红外原始光谱Fig.1 Original near infrared spectrum of broccoli

图2 多元散射校正+一阶导数处理后光谱图Fig.2 Spectrum treated by multiplicative scatter correction+ first derivative

图3 多元散射校正+二阶导数处理后光谱图Fig.3 Spectrum treated by multiplicative scatter correction+second derivative treatment

2.3 青花菜矿质元素近红外光谱模型的建立

近红外模型的建立首先需要在PLS分析的基础上，采用不同数据处理方法进行处理，然后比较结果所得参数，再确定最合适的处理方法。通过MSC+FD、MSC+SD、SNV+FD和SNV+SD 4种数据处理方法进行数据处理，对RSQ和RPD进行比较，结果见表2。其中，RSQ是定标相关系数，一般认为越接近1越好。RPD是相对分析误差，用来评估所得模型的预测能力，目前对此参数数值仍然存在不同的看法。

由表2可知，K、Mg、Ca数据经过MSC+FD处理后分析结果最好，此时RSQ分别为0.884、0.944、0.651，RPD分别为2.491、2.710、1.344；P数据经过SNV+FD处理的效果最好，RSQ和RPD分别为0.733和1.117；S、Fe经过MSC+SD处理后的结果最好，RSQ分别为0.523、0.581，RPD分别为1.133、1.100。可见，Mg的预测模型效果最佳，在校正和验证过程中均取得了较好的结果，不仅校正误差、验证误差均较低，且RPD>2.0；Sinnaeve等认为，RPD值大于2.5或大于2.0即有较好的预测结果，说明该校正的精度高，可以得到较为准确的预测结果。Manley等指出，RPD大于3才可以用于筛查，说明此模型还需要进一步优化。K预测模型的RSQ略低于Mg的预测模型，但RPD仍然大于2，处于较高水平，说明该模型有良好的预测性且稳定度较高。用验证集数据验证各模型得到青花菜中K和Mg含量的验证相关系数，分别为0.893、0.928，大于各自的校正相关系数，这种情况被认为是不合理的；但因差值极小，仍足以进行宏观营养元素的预测，且估计误差会很小。为此，后续可通过增加数据集的样本数量并重新计算模型，得到一般所需要模型(校正相关系数大于验证相关系数)。该研究结果与Menesatti等建立的一些元素(包括K、Mg)的模型结果相似，相关系数都大于0.82。此外，Karoui等研究表明，RSQ为0.50～0.65时，可以区分高浓度和低浓度；RSQ为0.66～0.81时，表示近似的定量预测；RSQ为0.82～0.90时，预测结果较好；RSQ高于0.91时，预测结果最好。Ca的RSQ为0.651，S的RSQ为0.5～0.65，Fe的RSQ为0.5～0.65，属于可建立区分高浓度和低浓度层次的模型；P的RSQ为0.66～0.81，可建立用于近似预测的模型。

表2 不同处理方法对青花菜中不同矿质元素组分定标方程的对比Table 2 Comparison of calibration equations of different mineral elements in broccoli by different treatment methods

结合以上分析，最终将MSC+FD处理作为预处理方法，对青花菜矿质元素Mg、K组分进行建模，建模后的模型如图4所示。效果图能直观地体现出模型的预测效果，Mg和K的样品数据点无规律地分布在直线两侧，整体呈均匀离散的趋势，且没有出现较大的偏差，说明Mg、K模型较准确，可用于青花菜中该2种元素的含量预测。P、Ca选择采用SNV+FD和MSC+FD进行预处理，建立的模型如图4所示。各数据比较均匀的分布在直线两侧，但存在少量数据比较离散的情况，因此，这2个模型的准确性有待加强，后续或可通过增加样品数据或将高低浓度区分开建立模型来进行改善。S和Fe的模型图采用MSC+SD进行预处理，从图4可知，数据分布离散，存在较大偏差，后续或可以通过建立高、低浓度2个模型来增加其准确度。

Mg、K采用多元散射校正+一阶导数处理作为预处理方法，P、Ca分别采用标准正态变量变换+一阶导数和多元散射校正+一阶导数进行预处理，S和Fe采用多元散射校正+二阶导数。Mg and K were pretreated by multivariate scattering correction+first derivative，P and Ca were pretreated by standard normal variable transformation+first derivative and multivariate scattering correction+first derivative respectively，S and Fe were pretreated by multivariate scattering correction+second derivative.图4 青花菜各矿质元素含量化学测试值与NIRS预测值的关系Fig.4 Relationship between chemical test values and NIRS prediction values of mineral elements in broccoli

3 结论

本研究选取了120份青花菜，采用ICP-OES测定矿质元素组分的含量，并利用近红外分析仪和TQ Aanlyst II软件，对数据进行处理和分析，建立了青花菜矿质元素组分的近红外检测模型。主要结论如下：对于青花菜矿质元素K、Mg和Ca采用MCS+FD处理后的模型较好；P经过SNV+FD处理的效果最好；S、Fe经过MSC+SD处理后的结果最好。K、Mg建立的模型可以用于实际应用，P的近红外模型可以近似地进行预测，S、Fe和Ca通过区分高浓度和低浓度，建立2个模型提高模型的准确度。根据本文的结果可知，近红外技术在快速测定青花菜矿质元素含量中有一定可行性，在此基础上，通过增加样品种类或是重复相同样品对模型进行进一步修订，可以提高模型的准确性。本研究为青花菜营养品质指标的快速检测提供了技术参考，可在育种实践中提高青花菜育种材料的筛选效率。