一种基于Image J软件的植物叶片表型参数测量方法

杨文源，俞 玉，张世媛，张 娟，玛伊努尔·图尔荪，杨 涛，徐丽萍，3

（1.伊犁师范大学生物与地理科学学院，新疆伊宁 835000；2.兰州城市学院信息工程学院，甘肃兰州 730000；3.伊犁师范大学资源与生态研究所，新疆伊宁 835000）

叶片是植物与外部环境交互的重要桥梁，是植物进行光合、蒸腾和呼吸作用的重要器官[1-2]。叶片表观特征反映的是植物对外界环境的适应以及在复杂生境下的自我调控能力[3-4]。因此，探究植物叶片表型塑性，对于揭示植物在不同生境下的适应性具有重要意义[5-6]。传统的网格法、称重法、系数回归法等植物叶片表型参数获取方法，或操作繁琐、效率低下，或精度较差、可靠性低[7-8]，不能很好地适用于植物叶片表型相关的科学研究。随着计算机技术的快速发展，基于数码相机或扫描仪与图像处理软件相结合的图像处理法，已成为科研和生产中植物叶片表型参数获取的热门方法，具有准确、快速、成本低廉、适合非破坏性动态连续观测等优点[9-11]。国内学者基于Image J 图像处理软件提出的几种植物叶片表型参数测量方法，或是只针对叶面积这一种表型参数，而不能对叶周长、叶长和叶宽等其他植物叶片表型参数进行测量[12-13]；或是虽然可以对多个植物叶片表型参数进行测量，但实际操作过程繁琐，使用费时费力，需要单个、手动地去选定操作，最后还需要人工对测量结果进行像素数目与实际长度之间的比例关系换算[14]，因此均无法在科学研究中开展高效的应用。Digimizer 软件也是目前广泛应用于植物叶片表型参数测量的一款软件[15-17]，与Image J 软件相比，在植物叶片表型参数测量方面具有一定的专业性和便捷性，但Digimizer 并不是一款可以永久免费使用的软件，长期使用需要付费且费用较高，因此也具有一定的局限性。除使用上述两种软件测量的方法外，虽还有利用Photoshop、Arc GIS[18]等软件对植物叶片表型参数进行测量的方法，但都操作繁琐或需要具备一定的计算机编程基础，且与使用Image J、Digimizer 软件测量的方法相比较，还不能实现同时对多个叶片的处理[14]。综上所述，基于Image J 软件开源免费、使用广泛、操作简便易获取的优点，本文在结合前人有关Image J 软件分析物体表面几何特征方法[19-21]研究的基础上对戴志聪等[14]的研究方法进行优化改进，并将改进后的方法与使用Digimizer软件测量的方法进行比较验证。由此，提出了一种新的基于扫描仪和Image J 软件的低成本、快速、精确、批量测量植物叶片表型参数的方法，以期为植物叶片表型参数的测量提供一定参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于2022年在伊犁师范大学产学研成果转化孵化基地进行，香瓜茄（Solanum muricatum）叶片取自基地中所引种栽培的“绿源一号”香瓜茄，该品种于2021年购于甘肃省武威市民勤县人参果脱毒育苗中心。随机选取不同香瓜茄植株、不同位置的83 片形态完整且无病虫害的叶片，清洗干净，用吸水纸拭干水分后备用。

1.2 主要软件与设备

试验所使用的Image J 软件（即下文中的Fiji 软件，它是Image J 软件的一个版本） 于官方网站https：//Image J.net/Fiji/Downloads 获取。所用电脑基本配置情况：Windows 11 操作系统（64 位）、Intel（R）Core（TM）i5-11320H 处理器、NVIDIA GeForce MX450显卡、16 GB 运行内存（RAM）。所用扫描仪的品牌型号是联想M7605D（越南产）。

1.3 叶片数字图像采集

将待测植物叶片样品，整齐地排列在扫描仪的平板玻璃上，然后在叶片样品旁放置一个刻度尺作为参照物，盖上扫描仪盖板，设置好扫描仪的扫描参数（JPEG 格式、彩色、300 dpi），点击扫描，得到待测叶片样品的数字图像，对扫描得到的叶片数字图像进行命名编号后，将其存储于特定的文件夹中用作后续的处理分析。

1.4 测量指标及方法

1.4.1 测量指标

试验中所测量的叶面积是包含叶柄部分的单面叶片面积[10]，叶周长是包含叶柄部分的叶片周长，叶长是叶柄基部至叶尖的直线距离，叶宽是两侧叶缘间垂直叶柄基部与叶梢连线的最宽距离。

1.4.2 测量方法

Digimizer 软件的具体操作方法参照参考文献［9］。改进后的Image J 软件测量植物叶片表型参数的具体操作步骤如下。

（1）导入图片：打开Fiji 软件，点击“File→Open”，导入待分析的图片（图1A）。或直接将图片拖放至操作栏打开。

（2）设置比例关系：找到并使用操作栏中的“Magnifying glass”工具，将图片适当放大，然后使用“Straight line”工具，按住“Shift”键，沿着待分析图片中的标尺描绘一定长度水平直线。直线绘制完成后，依次点击“Analyze→Set Scale”，在弹窗页面“Known distance”一栏中输入直线长度，“Unit of length”中输入长度单位，其他选项默认，然后点击“OK”（图1B）。在处理同批次规格相同的图片时，勾选“Global”选项，即可自动添加比例关系。

（3）灰度转换：依次点击“Image→Type→8-bit”，将RGB 格式的图片转换为灰阶图像（图1C）。直接以灰度格式扫描获取的图片可省略此步骤。

（4）图像背景校正与增强：依次点击“Image→Adjust→Threshold”，软件会自动用红色将待测叶片填充，然后点击“Apply”（图1D）。

（5）测量选项设置：依次点击“Analyze→Set Measurements ”，勾选“Area”“Perimeter”和“Feret′s diameter”选项，在“Decimal places”中可根据测量精度要求，设置数据精准度（图1E）。软件具有记忆功能，第1 次勾选后，后续每次操作时软件都会自动勾选上次的测量值选项，无须重复操作。

（6）测量结果导出：依次点击“Analyze→Analyze Particles”，在弹窗页面“Size”一栏中设置面积过滤条件，目测估计叶片大小，将0 改为最小阈值，以去除干扰信息。在“Show”中勾选“Outlines”，下面勾选“Display results”，点击“OK”，即可弹出测量结果。弹窗页面中“Area”是叶片面积、“Perimeter”是叶片周长、“Feret”是叶长、“MinFeret”是叶宽，然后再点击弹窗页面左上角“File”，即可通过Excel 的表格形式将结果导出（图1F）。

图1 Image J 软件法测量步骤

1.5 数据处理及分析

使用Image J 软件与Digimizer 软件分别对香瓜茄叶片表型参数进行测量，以Digimizer 软件测量得到的结果为基准，与Image J 软件所测得的结果进行对比。采用均方根误差（RMSE）和标准均方根误差（NRMSE）等统计值进行分析和验证，从而说明使用Image J 软件测量植物叶片表型参数的可行性及准确性。

式中：Oi、Si和n分别表示ImageJ 软件的测量结果、Digimizer软件的测量结果和样本容量；为Image J 软件测量结果的平均值。当NRMSE值小于10%，表示两种软件测量结果之间一致性非常好；10%～20%为较好；20%～30%为一致性一般；若大于30%则表示两种软件测量结果之间偏差较大[22]。

2.2 两组患者手术前后心功能变化比较 两组术后二尖瓣反流面积减小(P<0.05)，左室射血分数升高(P<0.05)。与A组比较，B组二尖瓣反流面积减小和左室射血分数升高更明显(P<0.05)。两组患者术后左心室舒张期末内径均有所减小，但两组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

使用WPS Office 2021 中的表格工具进行试验数据的处理及论文图表的制作，所有植物叶片表型参数数据均是5 次测量结果的平均值。

2 结果与分析

2.1 植物叶片表型参数不同测量方法的相关性分析

对使用Image J 软件与Digimizer 软件测量得到的香瓜茄叶片（n=83）表型参数数据进行相关性分析（图2）可知，两种软件测量得到的香瓜茄叶面积、叶周长、叶长和叶宽结果的标准均方根误差（NRMSE）分别为0.471%、1.103%、0.391%和1.662%，除叶宽外，其他叶片表型参数测量结果的相关系数均在0.99 以上（叶宽的相关系数偏低，R2=0.979）。与使用Digimizer 软件测量得到的结果有较高的一致性，由此可说明使用Image J 软件测量植物叶片表型参数的方法具有较高的精确度。

图2 Image J 软件与Digimizer 软件测得的香瓜茄叶片表型性状数据比较

2.2 图像质量对Image J 软件测量结果的影响

对选定的同一批香瓜茄叶片（n=8）以不同图像格式、分辨率进行扫描并分析结果。由表1、表2 可知，在图像格式一致时，除叶周长外，图像分辨率对Image J 软件的测量结果无显著影响，变异系数小于0.10%。在图像分辨率一定时，图像格式会对Image J软件的测量结果有较大影响，随着图像分辨率的提高，这种影响也会越来越明显。图像质量会对Image J软件的测量结果有一定影响，对灰度格式图像的影响要小于彩色格式图像。

表1 图像格式与分辨率对Image J 软件测量结果（叶面积、叶周长）的影响

表2 图像格式与分辨率对Image J 软件测量结果（叶长、叶宽）的影响

3 讨论与结论

两种软件叶宽测量结果的相关系数偏低（R2=0.979），这可能与扫描时叶片的排列方向及扫描仪自身的工作原理有关，扫描仪在工作时，扫描头上的灯光会从一个方向照射到叶片，由于叶片具有一定厚度，所以会在另一个方向产生阴影，这与日常扫描或复印身份证时，总有一边会产生阴影的原因相同，不同软件在识别处理阴影图像边缘方面的能力会有一定差异，而这种差异对叶宽的影响要大于其他指标，所以两者相关系数会相对于其他指标偏低。

图像质量对Image J 软件叶面积、叶长和叶宽的测量结果无显著影响，但会对叶周长的测量结果有较大影响，出现这种情况的原因可能是由于图像质量的提高，影响了软件对叶片边缘轮廓的检测识别[23]，因此建议在叶片扫描时以灰度格式和较低的分辨率获取图像，这样在保证结果测量精度的前提下，不仅可以节约磁盘空间，还可以简化Image J软件的操作步骤，提高工作效率。

与使用费用较高的叶面积仪等专业植物表型分析仪器测量的方法相比较，本试验提出的基于普通扫描仪和Image J 软件测量植物叶片表型参数的方法，无需任何经济支出，扫描仪是基础的办公设备，一般办公场所都会配备，而Image J 软件也是从官方网站上免费获取的，二者联合起来就可以对一些基础的叶片表型参数进行批量、快速的测量。在避免传统方法繁琐流程和专业仪器高昂成本的同时，获得了同专业植物表型参数分析仪器同样的使用体验，这对于普通科研工作者来说实用性很强，因为价格高昂的精密仪器不是每个科研院所都能配备并接触到的。本试验方法所需的软件设备简单易得，后期再结合Image J 软件自带的“Straight line”和“Angle tool”等工具即可实现对叶柄长度等更多叶片表型参数的测量。

本方法与使用Digimizer 软件测量得到的香瓜茄叶面积、叶周长、叶长和叶宽结果的标准均方根误差（NRMSE） 分别为0.471%、1.103%、0.391%和1.662%，相关系数均大于0.97。图像质量会对Image J软件的测量结果有一定影响，对灰度格式或低分辨率图像的影响要小于彩色格式或高分辨率图像，两种因素叠加会加剧这种影响。但总体来说，使用Image J 软件测量植物叶片表型参数的这种方法对图像质量的要求不高且可靠性好。但是也存在一定缺点，如具有破坏性，不能连续地去监测植物叶片表型参数的变化情况，但是后期可以用数码相机获取植物叶片图像的方案来解决。本试验提出的这种新的基于扫描仪和Image J 软件的植物叶片表型参数测量方法具有低成本、半自动、快速、精确、批量的特点，可为科研中植物叶片表型参数的测量工作提供参考。