心力衰竭病人TLR4/NF-κB信号通路、vWF、D-二聚体水平变化及其与心力衰竭程度、LVEF的相关性分析

梁魏昉

心力衰竭是作为各种器质性心脏病的终末阶段，发病率及病死率较高[1-2]，研究表明，免疫炎症反应及炎症细胞浸润为心力衰竭发生发展的病理机制之一，尤其是炎症反应及其造成的血流动力学紊乱是促进心脏重构及心功能恶化的重要因素，可作为反映病情进展及预后的独立预测因子[3-4]。近年来研究发现，Toll样受体(Toll like receptor，TLR)/核转录因子(nuclear transcription factors，NF-κB)信号通路介导的免疫炎性反应的激活可促进动脉粥样硬化、心肌缺血(再灌注损伤)等心血管疾病的发生、发展[5]。另有研究指出，心力衰竭病人炎症反应引起的血流动力学异常，血液呈高凝状态，其体内存在明显内皮功能损伤，且损伤程度与心力衰竭程度一致[6]。血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)是内皮功能损伤标志物，D-二聚体(D-dimer，D-D)为机体交联纤维蛋白降解产物，为反映机体凝血功能的指标之一[7-8]。基于此，本研究观察心力衰竭病人TLR4/NF-κB信号通路、vWF、D-D水平变化，并探究其与心力衰竭程度、左室射血分数(LVEF)的关系。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年10月—2020年10月我院收治的128例心力衰竭病人作为研究对象，均符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》中心力衰竭相关诊断标准[9]，并经临床病史、症状、体征及实验室、影像学等检查确诊。按照美国纽约心脏病协会(New York Heart Association，NYHA)心功能分级，其中Ⅱ级40例，Ⅲ级56例，Ⅳ级32例。排除标准：①近3个月内有较严重创伤或手术者；②合并脑血管疾病者；③伴有肝肾功能不全者；④合并急慢性感染、慢性阻塞性肺疾病者；⑤合并妊娠、内分泌疾病者；⑥心脏起搏器植入者；⑦伴有先天性心脏病、风湿性心脏病、心包病变、重度心脏瓣膜病者；⑧超声心动图检查图像质量较差，无法做出准确判断者；⑨合并恶性肿瘤者。

1.2 方法

1.2.1 基线资料收集 通过病案系统收集病人入院时临床资料，包括年龄、性别、体质指数、吸烟、饮酒、合并症(糖尿病、高血压、冠心病)、空腹血糖、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

1.2.2 血清指标检测 清晨空腹状态下抽取2 mL肘静脉血，3 000 r/min离心处理10 min，离心半径为15 cm，分离血清、血浆，采用凝血仪及其配套试剂盒(日本Syxmex公司生产，CA6000型)以免疫比浊法测定D-D水平；采用全自动生化分析仪及其配套试剂盒(瑞士罗氏E170型)以酶联免疫吸附法检测vWF水平；采用电化学发光全自动免疫分析仪(瑞士罗氏Elecsys-2010)测定B型利钠肽(B-type natriuretic peptide，BNP)、氨基酸末端B型利钠肽前体(plasma N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP)，计算BNP/NT-proBNP；以实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)测定外周血单核细胞TLR4、NF-κB mRNA；由美国Invitrogen公司提供的trizol提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书进行逆转录反应，RT-qPCR仪(美国ABI公司7300型)扩增，采用生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，同时以RT-qPCR仪器自带分析软件获得各样本、各基因扩增Ct，以β-actin作为内参照基因，目的基因表达相对值RQ=2-△△Ct。操作严格遵循仪器及试剂盒说明书进行。

1.2.3 超声心动图检查 采用彩色多普勒超声诊断仪(PHILIPS5500型)，探头频率1～5 MHz，参考美国超声心动图指南[10]进行测量，以实时三维超声心动图采集动态图像，脱机计算LVEF。

2 结 果

2.1 不同心功能分级心力衰竭病人临床资料比较 不同心功能分级心力衰竭程度病人年龄、BNP/NT-proBNP、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 不同心功能分级心力衰竭病人临床资料比较

(续表)

2.2 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF与心力衰竭严重程度的相关性 心力衰竭病人TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D与心力衰竭程度呈正相关(P<0.05)，LVEF与心力衰竭程度呈负相关(P<0.05)。详见表2。

表2 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF与心力衰竭严重程度的相关性

2.3 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D与LVEF、BNP/NT-proBNP的相关性 心力衰竭病人TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D与LVEF呈负相关(r=-0.707，P<0.05；r=-0.780，P<0.05；r=-0.728，P<0.05；r=-0.898，P<0.05)，与BNP/NT-proBNP呈正相关(r=0.644，P<0.05；r=0.618，P<0.05；r=0.609，P<0.05；r=0.831，P<0.05)。详见图1～图8。

图1 TLR4 mRNA表达与LVEF的相关性分析

图2 NF-κB mRNA表达与LVEF的相关性分析

图3 vWF与LVEF的相关性分析

图4 D-D与LVEF的相关性分析

图5 TLR4 mRNA表达与BNP/NT-proBNP的相关性分析

图6 NF-κB mRNA表达与BNP/NT-proBNP的相关性分析

图7 vWF与BNP/NT-proBNP的相关性分析

图8 D-D与BNP/NT-proBNP的相关性分析

2.4 心力衰竭病人心力衰竭程度的影响因素分析 以心力衰竭病人心力衰竭程度作为因变量(Ⅱ级赋值为1，Ⅲ级赋值为2，Ⅳ级赋值为3)，将年龄、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF水平作为自变量，纳入Logistic回归分析，自变量赋值：年龄<60岁=0，≥60岁=1；TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D以平均值为界，≤平均值=0，>平均值=1；LVEF以平均值为界，<平均值=0，≥平均值=1。Logistic回归分析结果显示，年龄、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、BNP/NT-proBNP、LVEF水平均为心力衰竭病人心力衰竭程度的影响因素(P<0.05)。详见表3。

表3 心力衰竭病人心力衰竭程度的影响因素分析

2.5 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF对心力衰竭程度的鉴别诊断价值 以ROC曲线获取TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF鉴别诊断心力衰竭程度的AUC，结果显示，各指标联合诊断心功能Ⅲ级、Ⅳ级AUC分别为0.797，0.877，最佳敏感度分别为71.43%、75.00%，特异度分别为82.50%、93.75%。详见表4及图9、图10。

表4 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、vWF、D-D、LVEF对心力衰竭程度的鉴别诊断价值

图9 各指标诊断心力衰竭病人心功能Ⅳ级的ROC曲线

图10 各指标诊断心力衰竭病人心功能Ⅲ级的ROC曲线

3 讨 论

TLR作为参与特异性免疫的重要蛋白质分子，同时也是连接非特异性与特异性免疫的桥梁，在免疫炎性反应中发挥至关重要作用[11-12]。TLR4作为TLR家族重要成员之一，现已被作为心脑血管风险检测标志物，其在心力衰竭发生、发展过程中过度表达，且其介导的一系列信号传导通路致使病人心脏功能进一步减退[13]。TLR4信号传导途径根据接头蛋白不同可分为髓细分化蛋白依赖性与非依赖性途径，其中依赖性途径主要引起NF-κB的激活及核转位，并诱导炎症相关基因表达[14-15]。此外，NF-κB激活后还可加速细胞间黏附分子转录及受损细胞间黏附作用，进一步扩大炎症反应，形成恶性循环[16-17]。本研究中，TLR4 mRNA、NF-κB mRNA水平与心力衰竭病人心力衰竭程度呈正相关，分析原因，可能是由于免疫炎性反应始终贯穿心力衰竭发生与发展全过程，在心力衰竭病变过程中，TLR4/NF-κB信号通路过度激活，会产生大量免疫炎性因子进入血液循环，通过负性肌力作用，促使心肌细胞凋亡及心肌成纤维细胞增殖，加重心力衰竭程度。

有研究指出，TLR4的髓细分化蛋白依赖途径可通过引起NF-κB的激活，易位进入细胞核内，诱导黏附分子、共刺激分子等促炎细胞因子产生，加重血管损伤，加之心力衰竭病人血液高凝状态可促进下游免疫炎性因子对冠状动脉血管浸润，加重血管内皮损伤[18]，故推测心力衰竭病人TLR4/NF-κB与vWF、D-D水平有关。

D-D是一种由活化因子ⅩⅢ与纤维蛋白单体与中间聚合体交联，经纤溶酶水解形成的特异性降解产物，为纤溶过程标志物，可调节纤溶酶及凝血酶活性变化，反映机体内凝血系统及继发性纤溶系统的活性，判断机体处于高凝状态或纤溶亢进状态[19-21]。血液中D-D水平越高表明高凝状态越严重，进而致使机体心肌组织微循环障碍及缺氧缺血状态加重，造成心肌纤维化、心功能损伤、左心室重构等一系列心脏变化，最终导致心力衰竭[22-23]。vWF主要由内皮细胞合成、分泌，生理状态下参与止血的主要糖蛋白之一。在病理状态下，vWF不仅参与高凝状态形成，同时各类病理因素对血管内皮的复杂影响同样反映在血浆vWF水平变化方面[24-25]。vWF为血管内皮损伤因子重要成员，其在结构上包含了多个巯基结构，可通过诱导氧化应激反应，促进下游糖蛋白配体激活，从而引起冠状动脉血管内皮损伤，增加血管内皮下脂质沉积[26]。在血管内皮细胞完整性破坏的过程中，vWF大量释放，诱导下游单核细胞或巨噬细胞激活，增加其对于冠状动脉内皮下平滑肌细胞浸润，致使平滑肌细胞痉挛[27]。已有研究证实，心力衰竭病人vWF水平高于健康对照组[28]，充分说明心力衰竭病人存在凝血功能异常、高凝状态及血管内皮损伤。基于此，本研究进一步分析心力衰竭病人vWF、D-D水平与心力衰竭程度的相关性，结果显示，心力衰竭病人vWF、D-D与心力衰竭程度呈正相关，考虑原因，可能与心力衰竭病情发展过程中，免疫炎症反应加剧，血管内皮损伤严重，血液持续处于高凝状态有关。

本研究还显示，心力衰竭病人TLR4 mRNA、vWF、NF-κB mRNA、D-D与LVEF呈负相关，与目前公认的判断心力衰竭严重程度的指标BNP/NT-proBNP呈正相关。心力衰竭病人心脏压力容量负荷过重、心肌缺氧缺血及再灌注损伤均可引起心肌细胞表达下降，同时β受体下调也可影响心肌收缩、舒张功能，持续高度激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统与交感神经，引起心肌肥厚及心室重构。心室重构可进一步增加心肌损伤程度，进行性心肌重塑影响心室压力负荷及局部血运障碍，造成LVEF降低，最终导致心室内相对瘀滞的高凝状态。此外，本研究采用TLR4 mRNA、vWF、D-D、LVEF、NF-κB mRNA判断心力衰竭病人心力衰竭程度，结果显示，上述指标联合判断心力衰竭程度AUC最大，故临床可实时监测心力衰竭病人vWF、TLR4 mRNA、NF-κB mRNA、D-D、LVEF水平变化，旨在为临床治疗方案选择提供依据。

综上所述，心力衰竭病人TLR4 mRNA、vWF、NF-κB mRNA、D-D水平明显升高，升高水平与心力衰竭程度、LVEF有关，且在心力衰竭程度判断中具有重要意义，可为临床治疗方案及病情评估提供依据。