结直肠癌外周血循环肿瘤细胞研究进展*

罗善山

2016 年，我国结直肠癌发病率为17.4/105，位于恶性肿瘤排行榜中第2 位，死亡率为7.9/105[1]，其恶性程度高、复发转移率高、危害大。我国结直肠癌患者仅约11%诊断为早期，大部分患者就诊时，已经出现肿瘤远处转移[2]。肿瘤转移是一个涉及多步骤、多因素的复杂过程，具有转移潜能的肿瘤细胞脱离原发病灶，以极少的数量转移到血液、骨髓、淋巴结或远处器官中，运用常规病理检测手段（非免疫组化和分子生物学技术等）难以发现，这种现象称为肿瘤的微转移[3]。肿瘤转移的最初阶段，肿瘤细胞脱落、迁移、侵袭并进入血液循环，为最终形成可被影像学检测的肿瘤转移病灶提供了基础与条件。研究发现，外周血循环肿瘤细胞（CTCs）伴随着肿瘤发展过程并携带了其分子生物信息[4]。因此，随着生物技术等方面的发展，CTCs 检测及其与肿瘤的相关性逐渐成为临床研究的热点。本文就结直肠癌外周血CTCs 检测、临床意义方面进行综述。

1 CTCs概述

在1869 年，澳大利亚病理学家Ashworth 发现血液中存在一种特别的细胞，和尸检发现的肿瘤细胞相似，首次提出并报道了CTCs[5]。目前CTCs 的定义为：自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。进入循环未被清除的肿瘤细胞通过迁移、黏附、相互聚集形成微小癌栓，并在一定条件下发展为转移灶[6]。CTCs 是上皮组织来源的癌细胞，经过上皮间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）后，具有了迁移和侵袭血管的能力，研究认为其是导致体内肿瘤转移的主要原因[7-8]；大多数CTCs 受机体微环境影响而发生凋亡，一部分到达适宜的生态部位后，会发生EMT，重新获得肿瘤干细胞特性，并就此固定形成新的转移病灶[9]。区别于肿瘤标志物，CTCs 是具有肿瘤学生物活性的肿瘤细胞，其携带了肿瘤的所有分子生物学信息，在动态的监测下，可直接地反映肿瘤在各个阶段连续变化过程[8]。越来越多研究深入到肿瘤转移机制，以及生物医学检测技术的巨大进步，CTCs 的检测已有较大进展，这些检测系统在可重复性、敏感性、特异性和成本控制等许多方面已取得较为理想结果，其中较为成熟应用广泛富集技术，可从血液样本中富集CTCs，以及细胞计数、表型分析和单细胞分析等各种检测，有助于发现提前或早期肿瘤、预测预后、选择化疗和靶向治疗。

2 CTCs的检测

目前CTCs 的检测呈现手段多样化，敏感性和特异性高效的检测系统可分两大类：基于免疫亲和富集法和基于生物物理特性富集法。

2.1 基于免疫亲和富集法 基于免疫亲和富集法应用比较广泛，其中应用最多的是免疫磁分离方法，其中有正富集为上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和负富集基于CD45。EpCAM 是阳性富集技术中使用的标志物典型代表，具有上皮特异性，并且在大多数肿瘤中高度表达。近年来，研究者开发出许多基于EpCAM 的CTCs富集技术。其中，CellSearch 系统是第一个，也是唯一项通过美国FDA 批准用于临床的CTCs 检测技术。其原理是采用一种涂有EpCAM 且可同铁微粒相结合的抗体，称为铁磁流体，这种铁磁流体和CTCs 中EpCAM 有极强的特异性结合能力，结合后使用强力磁体将这些CTCs 从样本中提取出，然后使用基于4’，6-二氨基-2-苯基吲哚细胞核染色，CD45 别藻蓝蛋白特异性白细胞阴性选择和细胞角蛋白8，18，19-藻红蛋白特异性上皮细胞阳性选择来识别细胞，以此来计数CTCs。Balic 等[9]分别使用CellSearch 系统和OncoQuick 法检测外周血中CTCs，结果显示，OncoQuick 系统中61 例患者中14 例（23%）和CellSearch 系统中33 例（54%）中检测到至少一种CTCs（P<0.000 1），CellSearch检测出CTC 数量（平均20 个/7.5 mL 血液）大于OncoQuick（3 个/7.5 mL；P<0.000 1），结论认为，使用CellSearch 系统检测CTCs 更准确、更灵敏。CellSearch 系统是目前自动化程度最高的CTCs 检测技术，受人为因素影响较小，具有较高的特异性、敏感性及可重复性，但由于缺乏肿瘤特异性抗原，敏感度相对较低，会出现漏诊，且检验费用较高，使其在临床上的广泛应用受到一定限制。

寻找出CTCs 特异性分子标志物，是提高CTCs检测的有效方法。肿瘤生长速度远快于机体正常组织，快速分裂的肿瘤细胞表面过度表达叶酸受体（FRs），以此来吸收叶酸（FA），促进DNA 和RNA的生物合成。Zhu 等[10]使肿瘤靶向分子FA 和磁性纳米颗粒分别通过疏水相互作用和化学共轭作用涂覆在红细胞表面，后者粘附到CTCs 上，并且在磁场中分离获得的CTC-RBC 缀合物，离心后CTCs 捕获并计数。结果显示，捕获效率在90%以上，纯度高于75%。在相同条件下，远高于基于EpCAM 的免疫磁分离技术（捕获效率为80%，纯度为20%）。即使是特异性的分子标志物，也面临配体表达水平异质性不足的问题，利用抗体之间的协同作用可以提高CTC 检测技术的灵敏度，如使用在非小细胞肺癌中基于EGFR/HER3 的富集法[11]。

2.2 基于生物物理特性富集法 基于生物物理特性的富集技术，主要利用CTCs 和血细胞在大小、变形能力、密度和电学特性方面差异，进行离心、微滤、微流体操控、电泳等方法进行分离和计数。这种无须抗体标记或特殊处理的分离CTCs 方法更适用下游分析[12]。其可以捕获在各个阶段包括稀有细胞表型在内的各种表型的CTCs，有助于确定CTCs在指导治疗和预测预后。基于细胞大小的分离技术，主要是利用CTCs（大小为10～20 µm，变形性差）和血细胞（红细胞8 µm；白细胞7～12 µm；可变形性好）之间的差异性，选择合适的阈值进行分离。Oh 等[13]使用高密度微孔芯片过滤器富集76 例结直肠癌患者和20 例健康对照受试者CTCs，结果显示，50 例患者（阳性率为65.8%）检测到CTCs，阳性患者与高水平癌胚抗原表达和晚期癌症明显相关（P=0.038、0.017）。Ⅳ期患者CTCs 计数（12.47±24.00）显著高于Ⅰ～Ⅲ期（2.84±5.29）（P=0.005）和健康对照组（0.25±0.55）（P<0.001），结论认为这种基于细胞大小的新检测平台可预测结直肠癌患者预后。CTCs 的密度介于血浆和红细胞之间，但在白细胞密度范围内。利用密度介质的差异沉降系数和基于密度的梯度进行离心，使不同密度的细胞在分离液中实现分层分布，实现CTC 的分离。Campton 等[14]利用CTC 的特定密度，使用独特基于密度的分离装置将有核细胞从血液中分离，将白细胞和血小板的血沉棕黄层完全分离，移位到显微镜载玻片染色，使用显微镜对载玻片进行成像，结果显示，悬浮肿瘤细胞的回收率为90.5%～91%。虽然该系统的CTC 计数能力优于 CellSearch，但由于白细胞和CTCs 之间存在一些物理性质的重叠，导致特异性差和部分CTCs 丢失。

综上所述，基于免疫亲和力或生物物理特性的CTCs 富集技术存在一定的优势和局限性，集成微流控装置的出现很好地结合了两者的优点，提高了检测的灵敏度和特异性。Jiang 等[15]通过确定性横向位移（DLD）隔离结构、带有CD45 标记的免疫磁珠的自动纯化装置和涂有鼠尾胶原蛋白的捕获平台，组合成的一个集成微流体装置，通过从血液中捕获绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞，在转移性肿瘤患者捕获CTCs 阳性捕获率为83.3%。该装置与CellSearch 系统同时进行检测30 例肿瘤患者比较，结果显示，两种方法的捕获效率之间没有显著差异。然而，集成微流控装置在时间、样本量和分析成本方面显示出优势。

3 CTCs在结直肠癌中的临床意义

研究显示，在结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤中通过检测，均发现了CTCs[16]。通过研究CTCs 在肿瘤病情发展过程中的变化，可能可为筛查、预后判断、病情评估及治疗反应等方面提供预测信息。有关CellSearch 系统检测结直癌患者外周血CTCs 的临床研究，国内外已有报道。Yang等[17]通过基于免疫亲和负分离富集法检测良性结直肠病（结直肠息肉）和非转移性结直肠癌患者术前CTCs 发现，结直肠癌患者CTCs 计数显著高于结直肠息肉患者（3.47±0.32）个/3.2 mL vs（1.49±0.2）个/3.2 mL（P<0.001）。Tsai 等[18]通过检测健康对照受试者、结直肠腺瘤和结直肠癌患者外周血CTCs，结果显示，CTC 计数与恶化的疾病状态紧密相关（P<0.000 1），在95%结直肠癌分期和79%腺瘤性病变中显示出高度特异性（86%）和高度敏感性。与临床常用检查方法包括肠镜检查等比较，CTCs 检测有着更好的依从性，但是结肠镜检查和活检仍是诊断的金标准，筛查发现CTC阳性，可进一步进行内镜检查和活检确诊。研究发现CTCs 与胃癌、小细胞肺癌、淋巴结阳性的黑色素瘤、晚期胰腺癌临床病理参数及预后密切相关[19-22]。Sastre 等[23]通过使用CellSearch系统检测1 202 例结直肠癌外周血CTCs 表达，结果显示，CTCs ≥3 个/7.5 mL 组与不良的预后因素（较差的ECOG 评分、Ⅳ期、3 个以上部位转移、癌胚抗原水平升高）具有相关性。Huang 等[24]通过Meta 分析使用CellSearch 系统检测11 项研究1 847 例结直肠癌患者的外周血CTCs，CTCs>5 个/7.5 mL 为阳性值，结果显示，转移性结直肠癌组CTC 阳性率显著高于无转移组[OR=4.06，95%CI（1.74，9.50），P<0.01，I2=0%]，CTCs 阳性率与结直肠癌的总生存 率[HR=2.00，95%CI（1.49，2.69），P<0.01，I2=67.1%]和无进展生存时间[HR=1.80，95%CI（1.5，2.13），P<0.01，I2=43.9%]明显相关。Krebs 等[25]使用CellSearch 系统检测48 例使用高强度化疗方案卡培他滨、奥沙利铂+/-伊立替康联合贝伐单抗+/-西妥昔单抗治疗结直肠癌病例的外周血CTCs，结果显示，CTCs ≥3 个/7.5 mL 和CTCs<3 个/7.5 mL患者平均总生存时间分别为18.7 个月和22.3 个月（P=0.038），结论认为，通过CTCs 计数分层可以筛选出可能从强化治疗方案中受益的患者，避免低CTCs 组使用高毒性方案。同样地，Aranda等[26]分析349 例使用卡培他滨和奥沙利铂+/-伊立替康联合贝伐单抗一线治疗转移性结直肠癌外周血CTCs ≥3 个/7.5 mL 病例，结果显示，卡培他滨、奥沙利铂和伊立替康联合贝伐单抗组患者和卡培他滨和奥沙利铂联合贝伐单抗中位无进展生存时间分别为12.4 个月[95%CI（11.2，4.0）]和9.3 个月[95%CI（8.5，10.7）]，HR=0.64[95%CI（0.49，0.82），P=0.000 6]，结论认为，通过CTCs 计数分层可以有助于高强度化疗方案的选择。Yang 等[27]通过动态监测138 例结直肠癌根治术患者的CTCs，结果显示，术前和术后CTCs 阳性患者3 年复发率（53.8%）比术前CTCs 阳性但术后阴性患者（78.9%）低25.1%（P=0.004），结论认为术后CTCs 阳性根治性术患者是复发的独立预后危险因素。动态监测CTCs 可用于评估指导风险调整和个体化诊治。Tan等[28]使用基于细胞大小的生物物理特性富集法在化疗过程中动态转移性结直肠癌患者外周血CTCs，CTC 计数趋势与影像学测量定义的疾病进展和癌胚抗原（CEA）水平趋势呈正相关，并且CTCs 的变化更为敏感，提示可用于监测治疗期间对化疗和疾病进展/缓解的反应。

结直肠癌恶性程度高、异质性大、复发转移率高。不同患者对治疗的反应及预后相差巨大，使用单一的预测因子难以评估全部的治疗效果和预后。尽管CTC 检测作为结直肠癌判断预后和治疗选择有用标志物已引起广泛关注，由于缺乏用于评估癌症预后和进展的统一标准和临界值，仍难入进入广泛的临床应用。外周血CTCs 是否比传统的影像学等更早地准确预测肿瘤的进展或缓解？诸如此类问题还需要更多的研究揭示。