柴胡消石自拟方对结石性胆囊炎豚鼠胆囊病理及脂多糖、微囊蛋白-3的影响

马亦湘，安佳琳，杨成城，张少辉，张 涛，钱嘉惠，周春宇

(1. 北京中医药大学，北京 100029；2. 北京中医药大学东方医院，北京 100078)

结石性胆囊炎是临床常见疾病，通常由于结石导致胆囊管阻塞、扩张、水肿、胆汁淤积，引起细菌感染所致[1]。西医以抗感染及手术治疗为主，但抗感染治疗亦反复发作，手术治疗存在术后并发症。中医认为结石性胆囊炎属于“胁痛”“胆胀”“黄疸”等范畴，其发病与肝胆气郁密切相关[2-3]。本着中医治病求本的原则，本课题组以大柴胡汤为基础，结合临床经验设立柴胡消石自拟方，应用于结石性胆囊炎患者效果较好。本实验观察了柴胡消石自拟方对高脂饲料诱导的结石性胆囊炎豚鼠胆囊病理形态及血清中脂多糖(LPS)、微囊蛋白-3(CAV-3)水平的影响，旨在进一步探讨该方的作用及机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 普通级健康成年雌性豚鼠，体重(300±40)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK(京)2016-0011。所有动物均饲养于斯贝福(北京)生物技术有限公司动物实验室(SPF级)中，室温条件(22±2)℃，相对湿度保持在50%～60%，光照保持正常昼夜节律，并且饲养环境保持安静。分笼饲养，每日自由饮食、饮水。动物实验经斯贝福(北京)生物技术有限公司审核通过(20200524-01)。

1.2药物 柴胡消石自拟方，组方：柴胡15 g、黄芩9 g、赤芍9 g、枳实12 g、大枣12 g、大黄6 g、鸡内金12 g、金银花9 g、栀子9 g、蒲公英12 g、茵陈12 g、姜半夏8 g、白芍12 g、生姜15 g、木香9 g，颗粒剂购自北京医珍堂中医诊所有限公司(货号：20016996)。70 kg成年人日有效剂量为161 g，即2 300 mg/kg，参考《中药药理实验方法学》[4]中人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值，豚鼠灌胃剂量=人的每日剂量(2 300 mg/kg)×70 kg×0.031/400 g=12.5 g/kg，故400g豚鼠的用药剂量为5g/d，按照2mL/g的标准稀释颗粒制剂，豚鼠的中药灌胃剂量为10 mL/d。

1.3试剂及致石饲料 通用型4%组织固定液、苏木素染液、豚鼠LPS ELISA检测试剂盒、豚鼠CAV-3 ELISA检测试剂盒、切片石蜡，购自北京泰科美生物科技有限公司。致石饲料：综合参考文献[5-8]的造模方法，选取酪蛋白1%、蔗糖1.5%、猪油1%、胆酸0.02%、胆固醇0.05%与普通饲料充分混合的方法，饲料购自北京欧北实验科技有限公司。

1.4实验方法 将30只豚鼠按照随机数字法分为3组，每组10只。模型组和柴胡消石自拟方组豚鼠普通饲料适应性饲养7 d后，连续喂以高胆固醇致石饲料4周建立结石性胆囊炎模型。造模成功后，参考文献[9]方法，空白组和模型组灌胃生理盐水10 mL/d，柴胡消石自拟方组灌胃柴胡消石自拟方颗粒剂10 mL/d，均1次/d，连续灌胃4周，各组饲料的喂养与灌胃前相同。

1.5观察指标及方法

1.5.1豚鼠一般状态及胆囊形态 实验过程中观察豚鼠一般状态，末次给药后禁食12 h，豚鼠称重，10%水合氯醛0.2～0.3 g/kg麻醉。固定豚鼠，解剖腹部，腹主动脉取血后完整切除胆囊，于胆囊颈部离断，肉眼观察胆囊形态。取约2 mm×2 mm胆囊组织用4%组织固定液固定，用梯度浓度乙醇按75%，85%，95%的序列浸泡脱水，石蜡包埋，包埋好的蜡块置于切片机上，切成5 μm薄片，HE染色，光学显微镜下观察胆囊病理形态。

1.5.2血清LPS、CAV-3水平 取腹主动脉血5 mL，在室温下静置2 h，4 ℃下3 000 r/min离心15 min，分离得到上层血清，按照LPS、CAV-3 ELISA检测试剂盒说明操作，在450 nm波长处测量各孔的光密度。

2 结 果

2.1各组豚鼠一般状态 空白组豚鼠体重自然增长，精神良好，反应灵敏，动作迅捷，呼吸平稳，毛色光洁，大便正常；模型组豚鼠在造模过程中体重增长缓慢，精神不振，反应迟钝，动作迟缓，呼吸稍弱，皮毛枯槁，蓬起易脱，眼睛黯淡无光，弓背，扎堆；灌胃后，柴胡消石自拟方组豚鼠体重、精神状况、反应能力、皮毛光泽度等较模型组有明显改善，有向空白组豚鼠恢复的趋势。

2.2各组豚鼠肉眼观察胆囊形态 空白组豚鼠胆囊颜色红润，大小形态正常，血运良好，胆汁透亮，剖开胆囊壁未见增厚，有血管附着；模型组豚鼠胆囊颜色较深，体积增大，血运不佳，出现明显的炎症，胆汁浑浊，剖开见胆囊壁增厚，胆囊内可见灰色泥沙样颗粒；柴胡消石自拟方组胆囊颜色较模型组浅，但不如空白组红润透亮，胆汁清澈，胆囊壁轻微增厚，胆囊壁无水肿，炎症明显减轻，胆囊内少量灰色泥沙样颗粒沉淀。见图1。

图1 肉眼观察空白组和结石性胆囊炎各组豚鼠胆囊形态

2.3各组豚鼠胆囊组织病理表现 空白组豚鼠胆囊黏膜上皮细胞呈单层柱状整齐排列，黏膜皱襞完整，囊壁未见充血、水肿及炎性细胞浸润；模型组豚鼠胆囊部分腺上皮脱落或增生，黏膜间质水肿、充血，有大量炎性细胞浸润；柴胡消石自拟方组豚鼠的病理改变较模型组轻，淋巴细胞、浆细胞浸润不明显。见图2。

图2 空白组和结石性胆囊炎各组豚鼠胆囊组织病理表现(HE染色)

2.4各组豚鼠血清学指标 模型组血清LPS、CAV-3水平均明显高于空白组(P均<0.05)；柴胡消石自拟方组血清LPS、CAV-3水平均明显低于模型组(P均<0.05)，与空白组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 空白组和结石性胆囊炎各组豚鼠血清LPS、CAV-3水平比较

3 讨 论

柴胡消石自拟方基于大柴胡汤，并参考各类代表文献中特效药物，结合临床经验进行加减改良而成，方中柴胡配黄芩以和解清热，除少阳之邪；大黄配枳实共泻阳明之热，配茵陈则逐瘀泻热，另取栀子通利三焦之功，三药合用则导瘀热至二便而去；方中加芍药以柔肝缓急止痛，缓解腹中痛，与枳实配伍可理气和血，疏肝而不伤肝；加半夏、生姜则可调和脾胃，缓解恶心呕吐；加金银花、蒲公英以清热利湿；加木香以行气止痛；配鸡内金以排石消石。诸药合用，共同发挥清热利湿、排石消石、疏利肝胆止痛之功。现代药理学研究表明，金银花、蒲公英、木香、栀子、茵陈能增加胆囊平滑肌张力，调节胆汁流量，并促进胆囊收缩和胆汁排泄，具有明显的利胆功效[10-13]。因此，不论是从中药方剂的功效及配伍，还是从现代中药药理研究来看，柴胡消石自拟方具有明显的利胆消石功效。

结石性胆囊炎通常由于结石堵塞胆囊管，引起胆汁排泄不畅而滞留胆囊内，导致胆囊黏膜层受到淤积胆汁中胆汁酸刺激和胃肠道细菌移位或者门静脉菌血症等因素影响[14-15]，进而出现水肿、充血、炎症反应等病理改变。本实验采用高脂饲料诱导构建豚鼠结石性胆囊炎模型，实验结束见模型组豚鼠胆囊黏膜间质水肿、充血、炎细胞浸润，与上述研究的结石性胆囊炎病理表现一致。经柴胡消石自拟方灌胃后，胆囊内无明显淋巴细胞、浆细胞浸润，水肿减轻，表明柴胡消石自拟方能够明显减轻胆囊炎症反应。

LPS为重要的炎性介质，其从细菌外壁释放出来，通过诱导体内单核/巨噬细胞合成并释放多种炎症介质进而参与免疫炎症反应。LPS主要由革兰阴性菌产生，而胆囊炎的致病菌多为革兰阴性杆菌，当机体受到严重创伤或出现严重感染时，全身的网状内皮系统功能障碍，免疫功能下降，内毒素产生过多，并通过消化道吸收入血，而机体无法全部清除，同时黏膜出血坏死，屏障破坏，血清内毒素水平明显上升[16]。相关研究显示，急性胆管炎时血清LPS浓度明显升高， 而LPS可以通过合成肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和蛋白激酶C诱导胆管上皮细胞MUC2和NUC5AC的过度表达，可能导致胆管黏液分泌增加和细菌感染[17-18]。此外，长期的胆囊结石可能损害肠道屏障，易发生肠道菌群移位，产生较多的革兰阴性菌，这可能导致机体LPS 水平升高，LPS可通过肠壁进入血流，引起全身或局部内毒素血症[19]。本实验中，通过高脂饲料诱导的结石性胆囊炎豚鼠胆囊内可见泥沙样颗粒，有明显的结石性胆囊炎表现，且血清LPS水平显著升高；经过柴胡消石自拟方灌胃后，豚鼠结石性胆囊炎好转，黏膜充血水肿明显减轻，血清LPS水平明显降低。提示柴胡消石自拟方能够通过影响血清LPS水平调控炎症反应，减轻胆囊炎症。

CAV-3是肌肉细胞的主要结构蛋白，在胆囊平滑肌中主要存在于内环肌，其表达受质膜上胆固醇调节。实验研究发现，CAV-3在胆囊组织的表达增加可使胆囊收缩素受体(CCK-AR)在微囊滞留，抑制胆囊CCK-AR的表达，影响胆囊平滑肌收缩，导致胆囊收缩障碍，胆囊动力低下，胆汁淤滞，促进胆固醇结晶析出、聚集，进而形成胆囊结石[20]。此外，CAV-3还可能通过抑制一氧化氮合酶(NOS)途径的激活进而减少NO的产生，增强Oddi’s括约肌收缩功能，进而降低胆囊动力[21]。本实验中，模型组豚鼠血清CAV-3水平明显升高，且肉眼观察胆囊体积增大、囊壁增厚，有明显的胆汁淤积表现，证实CAV-3对胆囊动力有影响；经过柴胡消石自拟方灌胃后，豚鼠血清CAV-3水平明显降低，胆囊体积缩小，表明柴胡消石自拟方能够通过降低血清CAV-3水平调控豚鼠胆囊动力，进而影响胆囊收缩运动，改善胆汁淤积，对结石性胆囊炎起到治疗作用。

综上所述，柴胡消石自拟方可抑制豚鼠血清中LPS、CAV-3的表达，从而明显减轻结石性胆囊炎豚鼠胆囊的炎症，调控胆囊动力，但其具体机制仍有待进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。