酱香型白酒大曲细菌与蛋白酶研究进展

吴海锋, 张 瑾, 陆祖军, 尚常花,3*

(1.广西师范大学 生命科学学院, 广西 桂林 541006;2.珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室(广西师范大学), 广西 桂林 541006;3.广西漓江流域景观资源保育与可持续利用重点实验室, 广西 桂林 541006)

中国白酒是世界著名的六大类蒸馏酒之一，是中国传统的发酵食品[1]，是使用大曲对谷物进行固态糖化、双边发酵获得的香味浓烈的蒸馏酒[2]。酒由曲定，有美酒必有佳曲在民间已口口相传[3-4],由此可见酒曲在白酒酿造中的重要地位。大曲多以小麦制成(小麦加水粉碎后，与母曲混合压块，在库中堆积后形成含各种菌和酶的大曲[5-6])，含有丰富的微生物种群及功能酶体系[7]，赋予大曲酒独特的风格与特色[8]。大曲中的微生物复杂多样，主要有细菌、酵母菌、霉菌三大类，其中产生蛋白酶及香味物质的主要是细菌。细菌在高温下能够降解大曲中的蛋白质组分合成酚类、酯类、醛类等物质，使得大曲具有特殊的香味。这类细菌包括醋酸菌、乳酸菌、芽孢杆菌等，它们在酿酒过程中作用各不相同[9-10]。本文阐述大曲中细菌种类及酶系的研究现状，为更好地调控白酒风味物质、改良传统工艺以及制造更加优质的白酒奠定理论基础，达到提高白酒酿造工艺水平的目的。

1 酱香型白酒大曲细菌的种类组成

大曲提供了白酒酿造所需的微生物。大曲制作过程因受到环境和原料的影响，其微生物种类非常复杂，主要包括霉菌、酵母菌、细菌和少量放线菌[11]。不同种类的菌在白酒酿造过程中所起的作用不相同，它们共同作用使白酒产生了复杂的风味，而细菌是大曲中产生蛋白酶和香味物质的重要种类[12]。王忠彦等[13]对高温大曲中的微生物类群进行研究，分别对曲皮和曲心在不同的温度下进行培养，发现高温大曲中的细菌最多，而霉菌、酵母菌和放线菌很少，因此认为高温大曲的菌系向细菌的方向转化。

1.1 大曲细菌的主要种类

1.1.1 芽孢杆菌

大曲中常见的细菌有芽孢杆菌、乳酸菌、醋酸菌等。Wang等[14]探究茅台大曲中细菌群落组成与发酵时间的关系，发现在酱香型大曲中芽孢杆菌属最多。芽孢杆菌在代谢过程中可以产生大量的蛋白酶、淀粉酶等，进而在发酵前期积累各种氨基酸和还原糖类[15]。罗建超等[16]从高温大曲中筛选出104株芽孢杆菌，其中产酱香的25株性能优秀的芽孢杆菌均能产生二乙酰、乙偶姻、蛋白酶、淀粉酶等，推测芽孢杆菌的产香机制可能是其在大曲发酵过程中产生蛋白酶和淀粉酶等多种酶，进而在高温、偏酸环境下通过美拉德反应产生吡嗪等多种香味物质。

李贤柏[17]从郎酒高温大曲中分离出产酱香能力较好的4株枯草芽孢杆菌。 连宾等[18]从茅台大曲中也筛选出产酱香的枯草芽孢杆菌。鲁珍等[19]以高温大曲为原料筛选出2株产酱香的芽孢杆菌，结合菌株生理生化特性和16S rDNA基因序列鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens和枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。刘婧玮等[20]从不同类型的高温大曲中筛选出31株芽孢杆菌，通过模拟大曲制作实验，证明其中1株菌为产酱香的蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus。张小龙等[21]从贵州某酒厂高温大曲中分离出2株产酱香的解淀粉芽孢杆菌，同时，发现这2株菌通过发酵可以产生多种风味物质，例如四甲基吡嗪等，酱香非常浓郁。综上所述，枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和腊样芽孢杆菌是形成酱香型白酒风味的重要种类。

芽孢杆菌属细菌，可以产生吡嗪类化合物，它是酱香型白酒风味形成的重要化合物，可以与白酒中其他的香味物质起叠加作用，使白酒香味浓郁。其中，四甲基吡嗪被认为是白酒中的主要功能性成分之一，对白酒酱香风味的产生有重要作用，在白酒的整体风格和质量等方面至关重要[22-23]。

1.1.2 乳酸菌

乳酸菌是大曲中常见的细菌，乳酸菌的类群及相对丰度对白酒发酵的影响很大。其主要发酵产物乳酸是中国白酒中必不可少的一类有机酸，它能够起到缓冲调和、提升浓厚度、延长后味、增加绵甜等作用。此外，乳酸在转酰基酶作用下生成乳酰辅酶A，进而在酯酶催化下与乙醇合成乳酸乙酯[24-25]。乳酸乙酯是白酒中香气物质的一种，对白酒风味的形成具有重要作用。中国蒸馏酒区别于国外蒸馏酒的显著特征之一就是乳酸乙酯的含量较高[26]。随着科技的进步，中国白酒中的乳酸菌具体物种正在被不断发现。高亦豹等[27]利用PCR结合DGGE技术探究5种高温和中温大曲中细菌的群落结构，结果表明融合魏斯氏菌Weissellacibaria、瑞士乳杆菌Lactobacillushelveticus、发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum、面包乳杆菌Lactobacilluspanis等乳酸菌普遍存在于不同工艺的大曲中。

吴正坤等[28]通过高通量测序，从不同贮存期的高温大曲中鉴定出乳杆菌属Lactobacillus、肠球菌属Enterococcus、乳球菌属Lactococcus、双歧杆菌属Bifidobacterium和片球菌属Pediococcus。其中，格氏乳球菌Lactococcusgarvieae占比最多。但是，通过平板主要筛选到植物乳杆菌Lactobacillusplantarum和粪肠球菌Enterococcusfaecalis，可能是这2种菌更适合在固体培养基上生长繁殖，导致它们在物种竞争中占据优势，但具体原因仍待后续深入研究。

张艳[29]通过MiSeq测序技术和Real-time PCR法发现乳酸菌是酱香型白酒发酵过程中的优势细菌，在检测到的8个属中乳杆菌属的种类最丰富，数量也最多；通过乳酸菌与酿酒酵母的相互作用实验，发现随着乳酸菌含量的增多，会影响特定酿酒酵母部分挥发性风味物质的代谢，但不会抑制其生长，也不会影响其代谢酒精的能力。因此，适量的乳酸菌可以维系酿酒过程中微生物区系的平衡，对酱香型白酒的品质会产生一定的影响。

1.1.3 醋酸菌

醋酸菌(acetic acid bacteria)是指一类能将乙醇氧化成乙酸(又称醋酸)的细菌。在白酒酿造过程中，醋酸是白酒的香味成分之一，对白酒风味形成起到一定的作用，但同时醋酸对微生物具有一定的毒性，酸度太高会抑制酿酒酵母的生长[30]。除了醋酸，乙酸乙酯也是白酒中含量较多的香味物质之一。吴轩德等[31]进行酿酒酵母与巴氏醋杆菌的混合发酵，发现当酿酒酵母生长旺盛时，巴氏醋杆菌的生长和乙酸乙酯的合成减弱，但是当酵母减弱乙醇发酵时，巴氏醋杆菌的生长速度、乙酸和乙酸乙酯的合成速度均增加，乙酸乙酯产量为单一菌株发酵时的10.1倍；研究发现乙酸乙酯主要由醋酸菌合成，酵母的部分成分及作用机制未知的发酵产物会削弱醋酸菌合成乙酸乙酯的能力，而活酵母可以部分去除这种削弱的效果。

芽孢杆菌属能够合成吡嗪类、芳香族类物质。乳酸菌能够合成乳酸，进而在酯酶催化下与乙醇合成乳酸乙酯。醋酸菌合成的乙酸乙酯和醋酸均可决定白酒的香味，能减弱刺激性、增加绵甜感。上述物质共同决定了白酒的风味，因此，对大曲中菌群组成以及微生物区系平衡的研究，可以为白酒品质提升、风味调控打下良好基础。

1.2 大曲细菌组成、大曲工艺与白酒风味的关系

大曲是生产白酒必不可少的发酵剂[32]，它不仅包含重要的粗酶和复杂的微生物区系，而且还是决定其产品风味特征的酿造和香气前体物的来源。大曲是通过小麦、大麦和(或)豌豆的固态发酵生产的，其生产采用传统的四阶段工艺：(i)配料、研磨、混合和成型；(ii)在自然环境中培养微生物；(iii)自发进行固态发酵1个月；(iv)在2～6个月的时间内干燥和成熟。最后一个阶段称为老化。因此，大曲的生产不是一个简单的过程。生产过程中的每一步都会影响大曲的质量，进而影响白酒质量。

在四步骤的生产过程中，老化是一个耗时的过程。尽管对长期成熟过程的内部机制没有明确的解释，但生产高品质白酒确实需要使用适当老化的大曲[33]。数千年来，人们非常小心地处理大曲的成熟过程，但迄今为止，大曲的制作没有获得充分的科学解释。在成熟过程中，将发酵大曲在通风良好的开阔区域放置一段时间，使其远离高温或湿气。老化是大曲生产过程中最复杂、最关键的环节。在这个过程中，大量的微生物、酶和挥发性化合物会产生和富集[7]。生产实践表明成熟后的大曲可以达到去除杂色、提升品质和增加香味的效果。以上论述表明，老化不仅仅是一个储存过程，还涉及微生物富集、初级和次级代谢过程以及在大曲成熟之前在混合物中发现的各种微生物和其他化合物的变化[34]。此外，老化会导致富集的微生物进一步发生相互作用，最终混合的微生物群落酿出稳定的白酒[34]。老化是一个平衡各种微生物和化学功能的过程。在这一时期，大曲中的风味物质种类及其含量由于微生物的活动而发生变化，调味以后形成受欢迎的白酒。Fan等[35]研究了大曲成熟过程中微生物群落的变化情况，发现在成熟过程中Firmicutes门细菌的丰度增加，而Proteobacteria门细菌的丰度降低。因此，在将来的研究中要对大曲制作过程中微生物群落组成的变化进行动态分析，才能更好地为白酒产业的发展提供理论指导。

2 酱香型大曲产蛋白酶细菌的分析

白酒中的香味成分复杂，蛋白酶将蛋白质降解为氨基酸，氨基酸作为前体物质经酶促反应合成各种各样的香味物质。例如，甘氨酸、半胱氨酸等分解后可以生成丙酮酸，丙酮酸进一步转变为乙醇或乙酸、乳酸等有机酸[36]。有研究发现，在酵母的乙醇发酵阶段，蛋白酶的加入可以充分降解发酵底物中的蛋白质，加速酵母细胞的增长，在48 h后可达4.1×108个/mL，为不加酶的2.7倍[37]。因此，蛋白质及蛋白酶的作用对白酒的风味影响至关重要。大曲在制作过程中温度较高，使得耐高温的细菌成为高温大曲中的优势功能菌，同时也成为酱香型大曲中蛋白酶的主要产生菌[39-40]。

2.1 产酸性蛋白酶细菌的研究

水解肽键的酶统称为蛋白酶。根据蛋白酶最适pH的差异，可归类为酸性蛋白酶( pH=2.5～3)、中性蛋白酶(pH≈7)和碱性蛋白酶(pH>8)。酿酒大曲代谢发酵底物时会产酸，因此，白酒生产中存在的蛋白酶主要是酸性蛋白酶[40]。酸性蛋白酶在酸性条件下会催化蛋白质分子分解生成多肽、小分子肽和氨基酸。在酱香型酒曲中，酸性蛋白酶具有很强的蛋白质分解能力，要高于浓香型近1倍，高于清香型近3倍[41]。

沈玉洁等[42]从白云边高温大曲中筛选得到1株产酸性蛋白酶活力较高的芽孢杆菌(固体发酵产酶活力达1 420.2 U/g)，经过VITEK-32微生物自动鉴定系统鉴定为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis。袁先铃等[43]对酱香型大曲中酸性蛋白酶产生菌进行分离鉴定，最终分离得到1株酶活力可达1 717.5 U/g的枯草芽孢杆菌。赖颖等[44]在大曲中分离得到产酸性蛋白酶的芽孢杆菌，在30 ℃、pH为5时活性最高。曾德勇等[45]从酱香型高温大曲中筛选出1株蛋白酶活力较高的解淀粉芽孢杆菌，经测定其产蛋白酶活力达847 U/g。王晓丹等[46]从酱香型大曲中分离了48株细菌，其中24株能够生成酸性蛋白酶，腐生葡萄球菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌产生的酸性蛋白酶活力比较高。

有研究表明，在酿酒过程中添加酸性蛋白酶可以缩短发酵周期，并提高0.5%的出酒率[47]。黄永光[48]在发酵过程添加酸性蛋白酶后，挥发性成分、总酸、酒精浓度分别为对照组的283.94%、136.17%和138.29%。酸性蛋白酶在白酒生产过程中已经被广泛应用，当前研究发现，产酸性蛋白酶的细菌大多为芽孢杆菌属，可能因为大曲生产过程中的高温环境使得部分菌无法繁殖，而芽孢杆菌可以在高温下产生芽孢抵御。由此可见芽孢杆菌在酱香型白酒风味形成中所占的地位之重。

2.2 产中性蛋白酶细菌的研究

区别于酸性蛋白酶作用的条件，酶与底物反应在pH值为6～7时活力达到最高，这类酶称为中性蛋白酶，可以降解蛋白质形成多肽及游离的小分子物质[49]。

高产中性蛋白酶的细菌联合产酸性蛋白酶的霉菌能够将原料中含有的复杂蛋白质降解[50]。朱国星等[51]从高温大曲中筛选出6株高产中性蛋白酶的芽孢杆菌，其中贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis蛋白酶活力最高，达到256.72 U/g。聂慧芳等[52]从酱香型大曲成品中筛选得到2株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌，活力分别达到5 022.57 U/g和4 359.25 U/g，尝试将其接种于由酱香型大曲原料制成的培养基中培养，取得了良好的效果。王婧等[53]从酱香型大曲中筛选获得了1株高产蛋白酶的地衣芽孢杆菌并模拟酱香型大曲的生产发酵工艺，通过梯度升温发酵，测得其所产的中性蛋白酶活力高达 3 925.80 U/g。肖蓓等[54]从高温大曲中筛选出15株嗜热菌，经鉴定为地衣芽孢杆菌，其在65 ℃产生比活力为68.3 U/g的中性蛋白酶。卫春会等[55]从浓香型大曲中筛选到1株产中性蛋白酶的细菌，40 ℃、pH 7条件下有最高的酶活，但酶对温度、pH的稳定性并不是很好。袁先岭等[44]通过优化培养基的产酶条件(无机盐含量)提高了中性蛋白酶的酶活(提高了555.1 U/g)。杨国华等[56]探究了茅台酱香大曲中合成中性蛋白酶的细菌种类、产酶条件，酶活达到2 900 U/g。

当前，关于大曲产生中性蛋白酶的研究大多以产酶菌的筛选分离纯化、产酶最佳条件的测定和培养基的优化为主，实际应用的案例极为少见，仍属于实验室规模。中性蛋白酶在酒曲中能够高效利用发酵底物促进发酵，可见在未来研究中中性蛋白酶的实际应用前景非常光明。

3 大曲品质与白酒风味的关系

浓香型白酒是中国白酒中名气最大的一类，因其独特的风味和香气，每年产量占我国白酒总量的70%以上[57]。浓香型白酒通过固态发酵法酿造，其中主要涉及大曲的生产和谷物的发酵，其特有的品质来源于一种传统的发酵剂(大曲)[58]。大曲制作在开放环境中进行，并不涉及灭菌过程。在这个过程中，液化酶、糖化酶、蛋白酶和酯化酶通过微生物代谢而积累[59]。在白酒中，大曲中的淀粉和蛋白质可以通过上述酶的作用被降解成小分子，进而作为营养物用于微生物的生长及作为风味物质代谢的底物[60]。这些酶主要由某些特定属的微生物产生，例如曲霉Aspergillus、根霉Rhizopus、芽孢杆菌Bacillus、乳杆菌Lactobacillus、威克汉姆酵母Wickerhamomyces及复膜孢酵母Saccharomycoposis[61-62]。大曲生产过程中微生物与微生物、微生物和环境之间的相互作用最终形成一个稳定的大曲微生物群体，参与随后的白酒酿造过程[63-64]。谷物发酵中来自大曲的细菌和真菌占比分别为81.5%和79.2%[65]，它们不仅影响发酵过程中酶的积累，而且决定最终的群落结构[66]。因此，大曲微生物群体对白酒品质形成的影响至关重要。如果掌握了浓香型大曲生产过程中微生物演替的规律，就可以得到高品质的大曲。

通过嗅觉闻到的“曲香”是评价大曲制作过程中微生物发酵的一个重要指标。作为一种感官指标，“曲香”主要代表大曲里的挥发性风味化合物。大曲的挥发性成分多种多样，例如，己醛、4-愈创木酚和苯乙醛是大曲中重要的香气活性成分，它们可能与大曲的品质密切相关[67]。大曲中栖息有很多物种，乳杆菌、芽孢杆菌、曲霉和一些酵母菌(复膜孢酵母、威克汉姆酵母和毕赤酵母)支配不同类型的大曲[68-69]。研究人员对大曲生产过程中与风味形成相关的微生物群落变化以及这些微生物群落如何通过代谢途径产生风味物质均知之甚少。使用标准品质的大曲是使得发酵标准化、保证稳定的浓香型白酒质量的一种最有效、最有潜力的方式。因此，研究大曲制作过程中微生物群落变化，结合代谢组分析，可以通过分析不同的代谢物了解微生物的代谢活性，为在大曲制作过程中实时监测微生物的生长和代谢提供理论指导。Deng等[70]测定了发酵过程中挥发性代谢物的含量，揭示了微生物群落和代谢物潜在的关联，为大曲发酵的品质监测奠定了良好的理论基础。

4 结语与展望

随着科技日新月异，关于酿酒大曲中微生物群落组成的知识不断丰富。大曲的品质将直接影响到白酒的品质和质量，不同地方酿造的白酒之所以口味不一，主要是酒曲中多种微生物及其产生的复杂酶系的共同作用不同。目前已有不少关于酒曲中微生物的研究，正逐步阐明细菌、霉菌、酵母菌等对酿酒过程的贡献。其中细菌是酱香型白酒酿酒大曲中合成香味物质、蛋白酶的关键微生物。高温下，部分芽孢杆菌可以借助产生芽孢存活下来，进而降解大曲中的蛋白质组分产生酚类、酯类等香味物质，使得大曲具有特殊的曲香味。在酱香型白酒大曲中，酱香物质或其前体的合成与美拉德反应、发酵、酶系密不可分。

本文对酱香型白酒大曲中细菌的多样性以及蛋白酶在酱香型白酒生产中应用的最新研究进行了综述，系统回顾从大曲中筛选出的细菌种类，包括芽孢杆菌、醋酸菌和乳酸菌等，其中在酱香型大曲的成品曲中芽孢杆菌丰度最高。芽孢杆菌能够合成吡嗪类、芳香族类和有机酸等，显著影响白酒的风味，在风味物质形成与酒体风格和质量等方面起着不可或缺的重要作用。而醋酸菌合成的醋酸不仅作为白酒的主要香味物质，也作为前体物进一步合成丁酸、己酸及其酯类。乳酸菌能显著地强化酿造过程，其代谢产物能明显地降低白酒的刺激性，提升白酒的绵甜感。

蛋白酶能够分解蛋白质，生成作为白酒香味成分前体物质的多种氨基酸。白酒生产中存在的主要是酸性蛋白酶。酱香型大曲中的酸性蛋白酶高于浓香型近1倍，高于清香型近3倍，具有很强的蛋白质分解力。大曲中酶的种类和数量直接影响到白酒的品质和风格。因此，依据微生物分泌的酶系解析酱香风味的产生机制，不仅有助于对酱香风味物质的探究，而且有助于通过生物工程技术获得性能优良的功能菌，进而增加基酒的优级品率，为酱香型白酒的酿造提供指导。从大曲的生产工艺上进行改进，对大曲中细菌的种类和数量进行优化，以及在酿造过程中适当地添加蛋白酶，从而提高特定风格白酒的品质将是未来白酒生产和研究的重点。