哈密瓜酵素制备工艺探索优化及性能*

魏玉娟，郁梅山，李雪梅，张 苗，王晶晶

(河西学院，甘肃 张掖 734000)

随着生活节奏加快，环境污染，社会竞争压力增大以及年龄的增加，都会引起人体内产生的酶减少，甚至酶的活性降低。酶数量和活性的降低都会导致各种疾病的发生[1]。微生物酵素食品是以乳酸菌、酵母菌等多菌种复合发酵瓜果、蔬菜，形成富含脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶及乳酸、醋酸、少量乙醇、矿物质、维生素等次生代谢产物的液态或固态食品[2-3]。所含多种活性酶具有改善体内微生态环境、润肠通便、美容养颜和降血糖等功效[4]。 微生物酵素产品主要盛行于日本、美国、一些欧洲国家及东南亚地区，且形成了品牌产业规模，而近十多年来，在中国也开始盛行起来，越来越多的酵素理念被引入到农业、食品、美容保健等领域[5-6]。

哈密瓜，古称“甜瓜”，在我国的新疆、甘肃省的瓜州、敦煌等地都有大量的种植，而一些有疤痕、裂口、个头不达标的哈密瓜无法销售，以废弃物的形式堆弃在田间地头，不仅是资源的浪费，还造成环境污染。

以哈密瓜直接生产酵素产品鲜有报道。本实验以哈密瓜为原料，加入不同菌种进行发酵，并通过实验探索不同菌种、接种量、发酵温度、发酵时间下的 pH、超氧化歧化酶(SOD)活性、羟自由基清除率、还原力来确定哈蜜瓜发酵制备酵素的最佳工艺条件。

1 实验部分

1.1 实验药品、原料及仪器设备

实验药品及原料：三羟甲基氨基甲烷(分析纯)、铁氰化钾(分析纯)，天津市光复精化研究所；乙二胺四乙酸(分析纯)、邻苯三酚(分析纯)，上海市医药工业公司；三氯化铁(分析纯)、邻二氮菲(分析纯)、磷酸二氢钠(分析纯)、磷酸氢二钠(分析纯)、硫酸亚铁铵(分析纯)、过氧化氢(分析纯)天津市福晨化学试剂厂；酵母菌(食品级)安琪酵母股份有限公司；乳酸菌(食品级)北京川秀科技有限公司；哈密瓜，张掖农副市场。

实验仪器设备：TDL-5台式离心机，常州翔天实验仪器厂；SHZ-D(III)循环水式真空泵，pHS-25pH计,巩义市予华仪器有限责任公司；400 W高压汞灯,自制。

1.2 实验工艺

1.2.1 哈密瓜预处理

先使用高压汞灯对工具、台面进行紫外线消毒，将挑选好的哈密瓜用蒸馏水清洗干净，在无菌台上去核去皮，切成小块，备用。

1.2.2 发酵工艺的优化

将新鲜切碎的哈密瓜分成5等份装入玻璃锥形瓶中，并分别加入10%(哈蜜瓜质量)的蔗糖。分别接种不同量的菌种，在保证发酵液充分溶氧的条件下，于30 ℃(或37 ℃)，发酵 48 h。在此期间，每隔3 h测每组实验的pH、超氧化歧化酶(SOD)活性、羟自由基清除率、还原力以确定哈蜜瓜发酵制备酵素的最佳工艺条件。

1.2.3 酵素性能的测定方法

1.2.3.1 pH值得的测定

用pH计测发酵液的pH值，测量前将pH计用标准液调至标准。

1.2.3.2 还原力的测定(铁氰化钾还原法)

取不同阶段样品2.5 mL于试管中，先后加入2.5 mL 浓度为0.2 mol/L 的磷酸缓冲液(pH=6.6)和2.5 mL质量分数为1%的铁氰化钾溶液充分混匀，置于50 ℃水浴反应20 min，结束后迅速冰浴冷却并加入2.5 mL质量分数为10%的三氯乙酸混匀，在3000 r/min 条件下离心10 min，吸取上清液5 mL置于另一试管内依次加入 4 mL 蒸馏水和1 mL浓度为1%的三氯化铁溶液，充分混匀后反应10 min，于700 nm波长处测定反应液吸光度，吸光度越大表明还原力越强，(蒸馏水做空白)。同时以相同浓度的Vc为阳性对照。

1.2.3.3 羟自由基清除力的测定(邻二氮菲法)[7]

按表1加样后，混合均匀，用超级恒温水浴控制温度在 37 ℃保温 1 h，于 536 nm 处测定吸光值A样品。同一测定重复3次。

表1 羟自由基清除力测定的加样量Table 1 Sampling amount for determination of hydroxyl radical scavenging power

羟自由基清除率=(A样品- A损)/(A空白- A损)×100%

式中，A样品：缓冲液+ FeSO4+邻二氮菲+样品+ H2O2；A空白：缓冲液+ FeSO4+邻二氮菲；A损伤：缓冲液+ FeSO4+邻二氮菲+ H2O2。

1.2.3.4 邻苯三酚自氧化法测定超氧化歧化酶(SOD)活性[8-9]

用超级恒温水浴控制温度在25 ℃，按表2的加样量，以Tris-HCl缓冲溶液为空白对照，在325 nm波长下每隔30 s测一次A0、AS共测6次。

表2 SOD活性测定加样量Table 2 Determination of SOD activity by adding samples

在此条件下，每钟抑制邻苯三酚自氧化率50%的酶量定为1个活力单位。

抑制率=(A0-AS)/AS×100%

SOD单位活力(U/mL)=[(A0-AS)/AS]/50%×反应总体积×(样品稀释倍数/样液体积)

式中：A0：自氧化速率；AS：加入样液后氧化速率。

2 结果与讨论

2.1 酵母菌接种量的确定

接种不同量酵母菌(配比如表3所示)于30 ℃[10]，发酵 48 h，发酵液pH变化。

表3 酵母菌接种量表Table 3 Yeast inoculation scale

由图1可以看出随着酵母菌接种量的增大，发酵液的pH值下降越快，下降到最低pH值时也不容易回升。接种量在0.02%和0.05%时在24 h时降到最低，随后一直处于缓慢的上升状态中，而接种量为0.1%、0.15%和0.2%时pH下降很快，几乎在9～15 h时发酵完成，发酵过程中有气泡产生，发酵不稳定，风味不佳。因此，酵母菌发酵的最佳接种量为0.02%。

图1 接种不同量酵母菌下发酵液的pH变化Fig.1 pH changes of fermentation broth inoculated with different amounts of yeast

2.2 乳酸菌接种量的确定

接种不同量乳酸菌(配比如表4所示)于37 ℃，发酵48 h，发酵液pH变化。

表4 乳酸菌接种量Table 4 Inoculation amount of lactic acid bacteria

由图2看出pH一直处于下降阶段，接种量在0.2%和0.5%时在21～24 h时降到最低，随后处于缓慢的上升状态中，而接种量为1%、1.5%和2%时pH下降过快，几乎在6～12 h时发酵完成，发酵过程中有起泡产生，酸味强烈。因此，乳酸菌发酵的最佳接种量为0.02%。

图2 接种不同量乳酸菌下发酵液的pH变化Fig.2 pH changes of fermentation broth inoculated with different amounts of lactic acid bacteria

2.3 发酵时间的确定

分别在三种条件下(配比如表5所示)，发酵48 h，发酵液pH、超氧化歧化酶(SOD)活性、羟自由基清除率、还原力的变化。

表5 不同菌种下的原料配比Table 5 Raw material ratio under different strains

2.3.1 发酵液pH变化

由图3可知哈密瓜酵素的 pH 在前24～27 h一直处于下降过程，之后一直处于缓慢的上升过程，发酵前 27 h 是由于酵母菌在无氧条件下产生乙醇和二氧化碳，发酵液中由于二氧化碳浓度上升，碳酸浓度也随之上升，而乳酸菌利用糖产生乳酸，因此pH值都下降。27 h后pH值处于缓慢上升，是由于微生物对发酵液中蛋白质水解和氨基酸的利用，产生乙酸及其它有机酸的共同作用结果[11]。酵母菌在27 h时的pH为3.72，酵母菌在27 h时pH为3.92，而双菌在24 h时pH最低为4.7，风味最佳。

图3 发酵过程中pH的变化Fig.3 Changes in pH during fermentation

2.3.2 发酵液SOD活性的变化

由图4可知，随着发酵时间的延长，SOD 活性一直处于上升阶段，酵母菌或乳酸菌单菌在27 h时达到最大值后都趋于平缓，双菌是30 h时达到最大值后开始下降，但三种工艺的SOD的变化差别不是很明显。

图4 发酵过程中SOD的变化Fig.4 Changes of SOD during fermentation

2.3.3 发酵液羟自由基清除率的变化

羟自由基属活性氧中的一种，可降解多糖、DNA和细胞膜等，是体内的强氧化，具有强氧化能力，在体内可与金属离子发生氧化，使金属离子形成高氧化态，促进人体衰老过程。羟自由基清除率利用显色反应，在536 nm处有最大吸收。

由图5可看出，随着发酵时间的增长，三种工艺的发酵液的羟自由基清除率呈现不断上升的趋势，在27～30 h 时羟自由基清除率达到最大，之后缓慢下降并趋于平缓，双菌发酵液的羟自由基清除率明显高于乳酸菌和酵母菌。分析原因可能是由于双菌中乳酸菌和酵母菌相互作用：乳酸菌将糖原分解成半乳糖和葡萄糖这些易于吸收的单糖，为酵母菌提供碳源[12]。并且有研究发现酵母菌和乳酸菌自身具有抗氧化能力，酵母菌的细胞壁多糖能够清除超氧阴离子自由基和羟自由基等活性氧[13]。故根据发酵过程中自由基清除率的变化，双菌发酵工艺较优。

图5 羟自由基清除率的变化Fig.5 Changes of hydroxyl radical scavenging rate

2.3.4 发酵液还原力的变化

一种物质的还原能力的大小反映其抗氧化活性的大小。

由图6看出，还原力一直处于上升阶段，说明随着发酵的进行发酵液中抗氧化成分增加，时也可以从图6看出酵母菌、乳酸菌和双菌的发酵最佳时间为 27～30 h。三种发酵工艺的发酵液还原力变化趋势差别不明显。

图6 发酵过程中还原力的变化Fig.6 Changes in reducing power during fermentation

3 结 论

通过综合分析各种情况下哈密瓜发酵工艺中的 pH 、还原力、羟自由基清除率、超氧化歧化酶(SOD)活性得出的结论是双菌发酵的效果比单菌酵母菌或乳酸菌的更好，探索优化的最佳哈密瓜发酵制备酵素的工艺参数为：在切碎哈密瓜中加入10%(哈密瓜量，下同)的蔗糖，20%的去离子水，0.02%的酵母菌接种量，0.2%乳酸菌接种量，在 30 ℃下，发酵 27 h，得到的哈密瓜酵素原液还原力最高，pH为4.5～5，羟自由基清除率>85%，超氧化歧化酶(SOD)单位活力>110 U/mL(110000 U/L)。本实验探索优化的哈密瓜发酵制备酵素工艺为工业加工生产哈密瓜酵素产品提供一定的参考。