不同收割时间下人工湿地芦苇根系分泌物的组成和特征

王俊力，刘福兴*，付子轼，乔红霞，陈桂发

1. 上海市农业科学院，上海 201403

2. 上海低碳农业工程技术研究中心，上海 201415

3. 上海十方生态园林股份有限公司，上海 200233

植物通过不同策略适应周围环境并做出反应，包括从根部向环境中分泌和释放各种化合物，即根系分泌物[1]. 根系分泌物作为植物与根际微生物相互作用的媒介，不仅可以通过改变生长环境的理化条件来调节植物性状，促进营养吸收，还可以为根际微生物提供碳源和能源[2]，并影响微生物的群落结构及其驱动的碳、氮循环反应[3-4]. 植物种类、生长阶段等自身因素以及环境、生长条件变化等外界因素均会影响根系分泌物的组成和含量[5-6].

芦苇(Phragmites australis)是湿地生态系统中的主要植物之一，全球分布广泛，在我国的亚热带季风气候区，芦苇通常在3月出芽，11月进入枯萎期[7]. 研究发现，枯萎期芦苇地上部分生长速度缓慢甚至停滞，地下根仍然生长[8]，但是由于光合作用减弱，会抑制氧气和有机物向根部输送，导致根系分泌物发生变化从而影响植物生长状况和根际微生物的结构及功能[9]；根系分泌物在植物生长初期分泌量最大，进入枯萎期后，逐渐降低，从而影响根际微生物活动，进而影响湿地中污染物的去除[10]. 收割是湿地植物最主要的管理措施之一，最优收割时间的研究对于平衡植物在湿地系统中的功能发挥、冬季湿地的污染物去除以及收割时人力、物力等有限资源的合理分配均具有重要意义. 研究[7,11-12]表明，枯萎期不同时间收割会影响芦苇湿地的脱氮效果、芦苇地上与地下部分的养分分配以及根系的呼吸代谢特征等. 而收割时间对枯萎期芦苇根系分泌物释放的影响、根系分泌物的组成和特征与污染物去除效果的关系等方面研究还鲜见报道. 该研究系统探讨了枯萎期不同收割时间情况下芦苇根系分泌物的组成和特征变化，及其与湿地总有机碳(TOC)和总氮(TN)去除率之间的关系，以期探索收割时间对植物根系分泌物的调控机制，指导芦苇收割的最佳时间，对人工湿地植物的维护与管理具有重要意义.

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验研究位于上海市农业科学院庄行综合试验基地(30°53′N、121°23′E). 该区属亚热带季风气候，多年平均降水量1 191.5 mm，蒸发量1 236.8 mm，年均温度16.1 ℃. 全年日照时数1 900.2 h，无霜期224.4 d.

1.2 试验设计

试验采取模拟芦苇湿地的方式进行，构建12个相同结构的传统水平潜流湿地系统(见图1)，长、宽、深分别为150 cm×50 cm×80 cm，进水端及出水端各设置长度为20 cm的布水区和集水区，并设有出水管，填料区长度为110 cm. 进出水均采用穿孔板，出水孔与出水管底标高一致. 为便于测定湿地内部的水质参数，在系统中间沿程竖向设置内径5 cm穿孔管. 填料粒径为1~2 cm的砾石，层深70 cm，运行时水在介质表面以下流动，水深为60 cm.

图 1 芦苇湿地试验系统示意Fig.1 Schematic diagram of a single reed wetland monitored experiment system

植物采用当地常见芦苇(Phragmites australis)，选取长势相近的芦苇幼苗移栽至根袋(300目尼龙网袋，20 cm×30 cm)中，袋内填料与袋外相同，系统内的初始种植密度为2株/袋(约29株/m2)，芦苇在系统中培养约2个月待长势平稳后，开始进水. 进水利用河道水配置，用尿素调节进水ρ(TN)，2年的进水ρ(TN)不同，第1年(2017年7月-2018年3月)较高(17.60~34.65 mg/L)，第2年(2018年8月-2019年4月)较低(3.16~10.03 mg/L)，进水水质参数如表1所示. 利用恒流泵进行连续进水，水力负荷(HLR)为100 mm/d，水力停留时间(HRT)为2.4 d. 系统运行约1个月趋于稳定后，正式开始试验，第1年试验结束后，重新布置第2年试验.

表 1 试验期间进水水质情况Table 1 Influent water quality during the experiment

研究地区的芦苇在11月末地上部分的营养物质会逐渐向地下部分转移[11]，该试验设置4个处理，即W1(对照，芦苇不收割)、W2〔枯萎前(10月)收割，营养物质转移前〕、W3〔枯萎中期(12月)收割，休眠期〕、W4〔枯萎末期(翌年2月)收割，出芽前〕，每个处理3次重复，各个时期植物生长状况详见Wang等[11]的研究. 收割方式为去除湿地系统表面10 cm以上的植物部分，并定期对凋落物进行清理. 以收割为节点将每年的试验分为4个阶段，具体时间范围如表2所示.2年试验各阶段的湿地TN去除率如表3所示，具体参见王俊力等[7]的研究.

表 2 试验期间关键时间节点Table 2 Key time nodes during the experiment

表 3 试验各阶段不同收割时间下湿地TN去除率变化[7]Table 3 Wetland TN removal efficiency of different harvest time treatments under different experimental stages[7]

1.3 取样与测定

水体取样进出水同时进行，进水在布水区采集(3个重复)，出水在每个湿地系统的出水口采集，每月一次(阶段1)，当收割开始后，每月2次(阶段2、3、4)，并现场测定系统水体中的pH、ORP、EC、DO浓度、温度(T)等指标.ρ(TOC)使用TOC分析仪(Apollo 9 000，Teledyne，美国)测定.

根系分泌物取样在每次收割时和试验结束时进行，方法是将根袋从系统中拿出，称取根袋内与植物根系结合紧密(根际区)的基质100 g(鲜质量)，在预冷无菌水冲洗、摇床振荡、过膜(0.45 μm)后，用甲醇萃取，固相萃取小柱采用Supelclean ENVI-18，经活化、上样、淋洗、洗脱、干燥后，氮气吹扫洗脱液浓缩定容至1 mL，用气相色谱-质谱联用仪(GCMS-QP2010，Shimadzu，日本)分析.

GC-MS分析条件：色谱条件为毛细管柱Rtx-5MS(30.0 m×0.32 mm×0.25 μm)；柱温50 ℃保持2 min，以6 ℃/min的速率升至250 ℃，保持10 min；进样口温度为230 ℃，载气He，采用不分流进样方式，流速为2.4 mL/min，进样量为1 μL. 质谱条件为EI电离方式，电子能量70 eV，离子源温度200 ℃，采用Scan采集方式，质量范围45~550 amu，扫描时间间隔0.2 s.样品质谱图与数据库(NIST11/NIST11s)进行相似度检索，保留相似度≥80%且2年试验和各处理的3次重复中均检出的组分进行后续分析.

1.4 数据处理

采用峰面积归一法计算根系分泌物含量，计算方法如下：

式中：R为各检测组分相对含量(相似度80%以上物质)，%；A为各检测组分的峰面积(相似度80%以上物质)，a.u.；At为检测组分总的峰面积(相似度80%以上所有物质)，a.u..

利用IBM SPSS 22.0软件对各参数进行统计分析，显著性检验采用Duncan在0.05显著性水平下进行；用SigmaPlot 12.5软件作图；用Canoco 5.0软件进行冗余分析.

2 结果与分析

2.1 枯萎期芦苇收割时间对湿地水体TOC的影响

从进出水ρ(TOC)(见图2)可以看出，第1年进水ρ(TOC)较高(11.71~19.27 mg/L)，第2年较低(3.28~10.64 mg/L)；经芦苇湿地处理后，2年间的各处理出水ρ(TOC)均低于进水.

图 2 不同收割时间处理下芦苇湿地的进水ρ(TOC)和TOC平均去除率Fig.2 TOC inflow concentration and removal efficiency of the reed wetlands under different harvest time treatments

2年试验不收割处理的TOC平均去除率相似，第1年为29.6%±16.3%，第2年为29.0%±22.2%. 与W1处理相比，W2处理阶段2的TOC平均去除率分别下降了36.7%(第1年)和7.3%(第2年)，随着时间延长，去除率降低趋势逐渐减小，阶段4则分别增加了6.1%(第1年)和55.7%(第1年)；W3处理阶段3和阶段4的TOC平均去除率在第1年均与W1处理相当，第2年则分别增加了40.9%和54.7%；W4处理阶段4的TOC平均去除率在第1年和第2年分别增加了29.2%和102.9%.

2.2 枯萎期芦苇收割时间对根系分泌物组成的影响

对2年试验和各处理3次重复中均检出的化合物组分进行分析，共检出10类35种化合物(见表4)，包括16种烷烃、5种酯、3种酮(含4-羟基-4-甲基-2-戊酮)、3种酸、2种醇、2种硅烷以及酚、醛、酰胺、噻唑各1种. 烷烃类化合物在种类数量上占优势地位(占比为45.7%)，结构特征上均为链状结构，其中正构烷烃7种，支链烷烃9种.

进一步分析不同处理检出的化合物数量(见图3)，2年试验各处理检出的化合物数量均大于20，且每个采样时期收割处理检出的化合物数量均少于不收割处理. 试验2年同期相比，第1年前2次采样检出的化合物数量均高于第2年，后2次采样则相反. 与W1处理相比，2年试验W2处理后均使烷烃数量明显减少，随着时间的延长，烷烃数量逐渐增加；2年试验W3和W4处理后均表现出烷烃数量增加的趋势. 其余种类化合物由于数量较少，在收割时间处理下的数量变化无明显规律.

2.3 枯萎期芦苇收割时间对根系分泌物相对含量的影响

以色谱图中检出的组分峰面积来比较各处理的根系分泌物总量(见图4)，2年试验的不同收割时间处理后，根系分泌物总量的变化趋势不同. 第1年，与不收割处理相比，收割处理均降低了芦苇根系分泌物总量，越早收割降低越为明显；第2年，W2和W4处理降低了刚收割后的根系分泌物总量，W3处理则增加了刚收割后的根系分泌物总量，但随着时间的延长，又低于W1处理.

第1年各处理根系分泌物中，烷烃类相对含量最高(45.9%~81.2%)，其次为酸类(5.1%~22.8%)和脂类(7.8%~12.9%)，与其他类型化合物相比达到差异显著水平(P＜0.05)；第2年，酸类相对含量最高(32.4%~62.6%，P＜0.05)，其次为烷烃类(12.5%~43.6%，P＜0.05).不同处理间比较，第1年，与W1处理相比，W2、W3和W4处理后均表现出烷烃类相对含量增加而酸类相对含量减少的趋势；第2年，W2处理后表现为酸类相对含量增加而烷烃类减少，随着时间的延长烷烃类又逐渐增加，W3处理后酸类和烷烃类相对含量均增加，W4处理后则表现为酸类相对含量减少而烷烃类增加的趋势.

表 4 不同收割时间处理下芦苇根系分泌物组成Table 4 Composition of reed root exudates under different harvest time treatment

2.4 湿地TOC和TN去除率与芦苇根系分泌物的关系

用RDA分析湿地TOC和TN去除率与芦苇根系分泌物的相互关系，以根系分泌物各类型含量(标准化峰面积)为环境变量，解释湿地TOC和TN去除率的变化(见图5). 试验第1年，烷烃类含量对湿地TOC和TN去除率的单独和条件效应解释量最高(48.8%)，二者与烷烃类含量均呈显著正相关(P＜0.05)；试验第2年，酸类含量对湿地TOC和TN去除率的单独和条件效应解释量最高(33.0%)，二者与酸类含量均呈显著负相关(P＜0.05)，烷烃类含量与湿地TOC去除率呈显著正相关性最大.

图 3 不同收割时间处理下芦苇根系分泌物中的组分个数Fig.3 Component number of reed root exudates under different harvest time treatments

图 4 不同收割时间处理下芦苇根系分泌物的总量和各类型的相对含量Fig.4 Total and relative amount of reed root exudates under different harvest time treatments

进一步分析烷烃类和酸类中各化合物含量对2年试验的湿地TOC和TN去除率变化的影响，结果如图5所示，试验第1年，3-甲基十四烷、二十烷、十四烷、2-甲基十五烷、十五烷、十八烷含量对湿地TOC和TN去除率的单独效应解释量分别为63.6%、59.6%、56.9%、55.0%、53.8%、31.8%，与TOC和TN去除率均呈显著正相关(P＜0.05)；试验第2年，硬脂酸、3-甲基十四烷、棕榈酸含量对湿地TOC和TN去除率的单独效应解释量分别为40.6%、33.1%、29.0%，其中湿地TOC和TN去除率与硬脂酸和棕榈酸含量呈显著负相关(P＜0.05)，与3-甲基十四烷含量呈显著正相关(P＜0.05).

图 5 湿地TOC和TN去除率与芦苇根系分泌物关系的RDA分析Fig.5 RDA analysis of wetland TOC and TN removal efficiency with reed root exudates

3 讨论

3.1 不同收割时间对湿地有机物去除效果的影响

湿地对有机物的去除主要依赖微生物的生物降解活动来实现[13]，该研究中，进水ρ(TOC)与ρ(TN)成正比，即试验第1年的进水ρ(TOC)和ρ(TN)均高于第2年，但两年间的湿地TOC平均去除率差异较小(第1年为29.6%±16.3%，第2年为29.0%±22.2%)，说明虽然进水ρ(TN)对湿地的脱氮效果有一定影响[7,11]，但进水ρ(TOC)对湿地有机物的去除效果可能影响不大. 湿地对有机物的去除效果与植物生长周期和季节变化相关，研究[14]表明，低温季节影响湿地的有机物去除效果，与该研究结果基本一致，冬季略微降低了湿地的TOC去除率，但与湿地脱氮效果相比影响较小，说明与脱氮菌相比，主要分解有机物的异养菌可能受温度的影响相对较小[14].

不同收割时间对湿地有机物去除效果产生影响，2年试验均表现出W1处理降低了湿地的TOC去除率，研究[15]表明，正在生长的植物会将光合产物以有机碳的形式分泌到环境中，为微生物提供碳源，产生根际效应[16]，庞大的根系也能为微生物的生长繁殖提供良好场所，通过根系泌氧为微生物提供充足的氧气，促进其代谢活动[17]，而枯萎前地上部收割会影响植物的光合作用和根系泌氧作用，从而影响微生物生长活动的根际微环境[18]，降低了微生物对有机物的降解.笔者研究结果表明，越晚收割则越能增加湿地的TOC去除率，可能是因为不收割的芦苇根系会持续分泌有机碳，而冬季微生物活动降低，对碳源的利用能力不足，根系分泌物释放反而影响了湿地的有机物去除效果，这与湿地脱氮效果结果不同，即与W1处理相比，收割处理均降低了湿地的脱氮效果，但W4处理对湿地脱氮效果的影响较小[7,11]. 2年试验均表现出W4处理后湿地TOC去除率增加的趋势，尤其是进水ρ(TOC)较低的年份增加显著(P＜0.05)，可能是因为W4处理后，根系本身分泌物量降低，加上气候逐渐变暖使微生物活动逐渐增强，平衡了根系分泌物释放量与微生物碳源利用量的关系，使有机物去除效果增加.

3.2 不同收割时间对根系分泌物组成和含量的影响

根系分泌物组成和含量变化是植物对环境变化响应的集中表现，当环境条件发生改变时，植物可以通过调节根系分泌物的释放来适应和改善其生长环境[19]. 研究[20]表明，烷烃、醇、醛、酮等小分子化合物，具有低分子量、低沸点、高蒸汽压、弱极性、亲脂性等特点，有能够长距离传播、介导有机体间非直接接触的相互作用和低浓度即可被感知等优势，在根际微环境中起着重要作用[21]. 该研究的芦苇根系分泌物中共检出10类化合物，包括烷烃、酯、酮、酸、醇、硅烷、酚、醛、酰胺、噻唑等，其中烷烃类在种类数量上占比(45.7%)相对较大，与韦雪晶等[22]研究结果一致，其检出芦苇根系分泌物中烷烃类无论在种类数量还是相对含量上均占优势. 已有研究[19]发现，香蒲根系分泌物组成有烷烃、烯烃、酸、苯酚、生物碱、脂、酮、醇、苯和唑等，烷烃类在种类数量和相对含量上占比亦较大. 烃类碳链结构稳定，较难降解，在自然界中广泛存在[6]，是植物根际微生物的重要碳源. 该研究中，虽然烷烃类在种类数量上占优势，但是在相对含量上可能与进水ρ(TN)有关，进水ρ(TN)较高的年份，烷烃类相对含量占比(45.9%~81.2%)最大，而进水ρ(TN)较低的年份，酸类相对含量占比(32.4%~62.6%)最大. 研究[23]表明，高氮胁迫下芦苇根系分泌有机酸会受到抑制，这可能是试验第1年根系分泌酸类化合物相对含量比第2年低的原因. 收割处理使根系分泌物在种类数量上有减少趋势，不同收割时间处理下烷烃类在数量上有较明显的变化，W2处理后烷烃类数量明显减少，W3和W4处理后均表现出烷烃类数量增加的趋势，这可能是植物通过调节根系分泌物的种类组成来适应收割干扰后生长状况的变化.

尽管2年试验的进水ρ(TN)不同，但根系分泌物总量没有表现出年份之间的差异，与Zhao等[2]研究结果相似. 从不同收割时间对根系分泌物总量的影响来看，除第2年的第3次采样外，收割处理均降低了芦苇根系分泌物总量，且进水ρ(TN)较高的年份，越早收割降低地越为明显. 收割是对植物生长的一种干扰，会影响光合产物以有机碳的形式从根部分泌，导致根系分泌物的降低，若进水ρ(TN)较高，芦苇根系活力亦较高[6]，植物生长代谢活动更加旺盛，枯萎前收割对植物的干扰相对更大. W4处理后，虽然根系分泌物的量降低，但湿地的TOC去除率却增加，可能与根系分泌物释放量与微生物碳源利用量的平衡有关.

植物根部可以释放不同类型的含碳化合物来刺激根际微生物的生长[24]，其中，烷烃类和酸类本身及其次生代谢产物具有一定的化感作用[25]. 研究[26]表明，环境因子胁迫能够诱导植物根系次生代谢途径发生改变，导致根系次生代谢物质成分发生变化，以抵御环境因子的胁迫，如香蒲在正常生境下，根系分泌烃类物质以正构烷烃为主，受到环境因子胁迫时，便会大量分泌支链烷烃和支链烯烃化合物. 酸类可作为有益菌在不同植物模式下的化学引诱剂[27]，从而有利于根际微生物的塑造和定殖，进而驱动植物生长和防御反馈[28]. 该研究中，2年试验的不同收割时间处理下，烷烃类和酸类相对含量变化趋势不同. 其中，第1年，与W1处理相比，刚收割后各处理均表现出烷烃类相对含量增加而酸类减少的趋势；第2年，不同收割时间处理后酸类和烷烃类相对含量变化趋势表现不同，这可能与进水ρ(TN)有关，植物生长环境中的氮浓度不同，受干扰后的表现也不同，植物通过调节根系分泌物的释放量，来满足自身适应环境变化的需要.

3.3 湿地污染物去除效果与根系分泌物的关系

通过RDA分析表明，湿地的TOC和TN去除率与根系分泌物含量之间密切相关，进水ρ(TN)较高的年份，烷烃类含量对湿地TOC和TN去除率的解释量(48.8%)最高，进水ρ(TN)较低的年份，酸类含量对湿地TOC和TN去除率解释量(33.0%)最高，说明环境中氮浓度不同，植物通过调节根系分泌物的组成和含量来适应收割干扰的策略不同，并与湿地污染物去除效果存在密切关系. 深入分析发现，进水ρ(TN)较高的年份，湿地TOC和TN去除率主要受烷烃类中3-甲基十四烷、二十烷、十四烷、2-甲基十五烷、十五烷、十八烷等含量影响，且均呈正相关. 进水ρ(TN)较低的年份，湿地TOC和TN去除率主要受酸类中硬脂酸、棕榈酸和烷烃类中3-甲基十四烷等含量影响，且与酸类含量呈负相关，与烷烃类含量呈正相关.研究[29-30]发现，二十六烷和十四烷能促进植物生长，而棕榈酸会抑制植物生长，这可能在一定程度上解释了该研究中湿地污染物去除效果与烷烃类含量呈正相关而与酸类含量呈负相关的原因，根系分泌物的组成和含量促进或抑制了植物生长，从而塑造了具有不同多样性和功能的根际微生物群落[2]，继而会影响湿地的污染物去除效果. 研究[31]发现，微生物也会释放丰富的以烃类为主的物质，而根系分泌物除包括根系的直接分泌产物外，还包括经微生物代谢或直接来自微生物本身的产物[32]，后续有必要更加深入研究和分离根系分泌物中的根系直接分泌产物和根际微生物本身代谢产物，并阐明其作用机制，以了解各调控机制在湿地污染物净化过程中的重要功能.

4 结论

a) 枯萎期不同时间收割影响芦苇湿地的有机物去除效果和根系分泌物的组成和特征. 与不收割处理相比，枯萎前收割会降低湿地的TOC去除率，枯萎末期收割会增加湿地的TOC去除率，即湿地芦苇在枯萎末期收割对有机物的去除效果最好.

b) 芦苇根系分泌物检出10类35种化合物，烷烃类数量占比最高. 与不收割处理相比，收割处理后根系分泌物数量均呈降低趋势.

c) 芦苇根系分泌物中组分相对含量受收割时间和进水ρ(TN)的影响. 进水ρ(TN)较高的年份，根系分泌物中烷烃类相对含量最大，收割处理后均烷烃类相对含量增加而酸类减少；进水ρ(TN)较低的年份，根系分泌物中酸类相对含量最大，枯萎前收割后酸类相对含量增加，烷烃类相对含量减少后又逐渐增加，枯萎中期收割后酸类和烷烃类相对含量均增加，枯萎末期收割后酸类相对含量减少而烷烃类增加.

d) 芦苇湿地TOC和TN去除率与根系分泌物的组成特征存在一定的相关性，进水ρ(TN)较高的年份主要受烷烃类含量的影响(呈正相关)；进水ρ(TN)较低的年份则主要受酸类含量的影响(呈负相关).