高效液相色谱串联质谱法测定水果、蔬菜中双胍辛胺的定性定量分析研究

尹丽丽

（上海华测品标检测技术服务有限公司，上海 201112）

双胍辛胺是一种广谱性杀真菌剂，对某些病原真菌有很高的生长抑制活性，其作用方式是抑制病菌类脂的生物合成，是触杀和预防性杀菌剂，对大多数由子囊菌和半知菌引起的真菌病害有很好的效果[1]。双胍辛胺主要在果树休眠期施用，可防治苹果树腐烂病、花腐病、葡萄黑痘病、芦笋茎枯病以及麦类雪腐病、腥黑穗病和柑橘贮藏病害，特别对柑橘青霉病、绿霉病和酸腐效果更好，对防治小麦雪腐病也非常有效。此外，其膏剂还被推荐作为野兔、鼠类和鸟类的驱避剂，同目前市场上的杀菌剂无交互抗性。其危害性主要有3 个方面。①健康危害：本品为中等毒性杀虫剂，对眼睛和皮肤有刺激作用。②环境危害：对环境可能有危害，对水体可造成污染。③燃爆危险：本品可燃，有毒，具有刺激性[2]。目前，检测水果、蔬菜中双胍辛胺的方法主要有比色法、气相色谱法、液相色谱法[3-4]。本文用正丁醇∶正己烷=1 ∶1 混合溶液提取，再用酸化水净化，建立水果、蔬菜中双胍辛胺的高效液相色谱质谱联用（High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）分析方法[5-11]。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

盐酸胍（分析纯），三乙胺（分析纯），氢氧化钠（分析纯），正丁醇（色谱级），正己烷（色谱级），氯化钠（分析纯），硫酸（分析纯），标准品：双胍辛胺三乙酸盐（CAS：57520-7-9），纯度＞98%；聚四氟乙烯膜（0.22 μm），上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

液相色谱-串联质谱仪：岛津8050，岛津（上海）实验器材有限公司；电子天平：感量0.000 1 g 和0.01 g，瑞士梅特勒；高速组织捣碎机：德国IKA；离心机：转速10 000 r·min-1，美国ThermoFisher；超纯水仪：美国Millipore 公司；超声提取器、涡旋振荡器：上海安谱实验科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液配制

称取适量双胍辛胺三乙酸盐于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，混匀，配制成浓度为 1.0 mg·mL-1的储备溶液，吸取0.1 mL 储备溶液至10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，混匀，配制成浓度为10 μg·mL-1的中间液，吸取适量中间液至空白样品基质中，按样品前处理流程操作，制备成浓度水平为10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1和500 ng·mL-1的 标 准 品工作液，现配现用。

1.3.2 样品前处理

称取2 g 试样（精确至0.01 g）于50 mL 刻度离心管中，加0.5 g盐酸胍，2 mL三乙胺溶液，0.5 g氯化钠，15 mL 正丁醇∶正己烷=1 ∶1，涡旋振荡提取 10 min，10 000 r·min-1离心10 min，上清液转移至预先装有1 mL 三乙胺的分液漏斗中，重复提取一次，合并上清液至分液漏斗中，加入4.7 mL 水和0.3 mL的1 mol·L-1硫酸，摇动提取5 min，静置10 min，取水相溶液过0.22 μm 的聚四氟乙烯膜，供HPLCMS/MS 进样分析测定。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY BEH HILIC 色谱柱（1.7 μm，2.1 mm ×100 mm）；流动相A：250 mmol·L-1乙酸铵溶液，流动相B：甲醇；流速：0.35 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：10 μL，流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 色谱条件-流动相梯度

1.3.4 质谱条件

电离方式：ESI+；监测模式：质谱多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；离子源温度：400 ℃；毛细管电压：4 kV，气流量：780 L·h-1；检测方式：MS/MS。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

根据双胍辛胺的分子量及化学性质，对其进行质谱条件的优化，其中离子源参数详见1.3.4。对双胍辛胺进行离子对优化，选择两对响应大、离子丰度大且干扰小的离子对分别作为定量和定性离子，此两对离子对再选择响应较大、丰度较大的离子对作为定量离子，采用MRM 方式进行分析，母离子、子离子对和碰撞能量见表2。

表2 母离子、子离子对和碰撞能量

在质谱条件优化的基础上，对液相条件进行了优化，最终确定了1.3.3 的液相条件，在此条件下，目标物能够在合适的时间被检测出，并能与干扰物很好地分离。

2.2 方法的标准工作曲线、检出限和定量限

采用空白样品基质提取液制备标准曲线，经过多点验证，最终确定曲线范围为10 ～500 ng·mL-1，在此范围内标准曲线的相关系数为0.999 7，呈现良好的线性关系。以3 倍信噪比为检出限，10 倍信噪比为定量限，双胍辛胺的检出限为0.002 0 mg·kg-1，定量限为0.011 mg·kg-1。

2.3 回收率和精密度

采用空白样品验证方法的回收率和精密度，具 体 操 作 为 在 空 白 样 中 分 别 添 加50 μg·kg-1、 100 μg·kg-1、500 μg·kg-13 个水平的标准品，采用本文确定的前处理及仪器条件，每个浓度值进行6 平行的重复测试，外标法校正，得出本实验方法的回收率如表3 所示。水果回收率在1.15%～4.45%；蔬菜回收率在96.2% ～110.0%；水果相对标准偏差为1.16% ～4.43%，蔬菜相对标准偏差为1.36%～2.15%，表明回收率和精密度都能满足检测需求。

表3 水果、蔬菜中双胍辛胺的回收率和精密度

3 结论

本文研究并建立了双胍辛胺的高效液相色谱串联质谱分析方法，通过实际基质样品验证，用基质加标建立的标准曲线，能得到良好的线性范围，回收率和精密度符合检测要求，检出限和定量限也均能满足测试需求。整个方法前处理相对简单、快速、高效，能满足水果、蔬菜中双胍辛胺的检测要求，此方法为双胍辛胺的检测提供了新的检测 手段。