液相色谱-串联质谱法测定猪肉中氯霉素残留量

谢冬霞

（深圳三方圆检测监管服务有限公司，广东深圳 518110）

氯霉素作为一种广谱抗生素，对革兰氏菌（阴性菌和阳性菌）有很好的抑制作用，因其具有稳定的药性、良好的抗菌性和价格低廉，曾在一段时间内作为细菌性疾病的治疗药物，在畜禽和水产养殖业中广泛应用。但人们在使用中发现氯霉素具有毒性，且CAP 会在动物性食品中残留，通过动物性食品对人的健康产生毒害作用[1]。研究表明，氯霉素存在严重的副作用，可引起人体的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏等疾病，因此残留在动物源性食品中的氯霉素对人类的健康构成了潜在的危害[2]。世界上很多国家禁止食源性动物使用氯霉素，我国农业农村部发布的第250 号公告也禁止其在食品动物中使用。目前，氯霉素的检测方法主要有酶联免疫法、金标试纸条法、高效液相色谱法、气相色谱法和液相色谱-串联质谱法等[3-5]，其中液相色谱-串联质谱法以其选择性高、灵敏度高、重现性好的优势，成为畜禽产品中氯霉素的常用检测方法。本研究参照 GB 31658.2—2021[6]，结合实验室设备条件和检测需求，建立了液相色谱-串联质谱法测定猪肉中氯霉残留量的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉（购于某农贸市场）。

氯霉素标准品（编号BW300320200， 纯度99.80%， 品 牌LGC）；氯霉素-D5（ 编 号BW901405-100-H，浓度为100 μg·mL-1，坛墨质检科技股份有限公司）；甲醇（色谱纯，赛默飞）；乙腈（色谱纯，赛默飞）；正己烷、乙酸乙酯、氯化钠（分析纯，西陇科学）；C18固相萃取柱（500 mg/3 mL，购于逗点生物）；实验用水符合GB/T 6682—2008二级。

1.2 仪器与设备

U1timate3000+TSQ Fortis 高效液相色谱质谱联用仪（美国赛默飞公司）；HZ-104/35S 分析天平（福州华志科学仪器）；JP-240ST 超声（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；DC-24氮吹仪（上海安谱科学仪器）；DDL5 大容量冷冻离心机（长沙英泰仪器有限公司）；WH-3 涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；明澈-TD 24UV 超纯水系统（Millipore）。

1.3 试样处理过程

称取5.00 g 试样于50 mL 离心管中，加入 250 μL 内标工作液、5 mL 乙腈、5 mL 4%氯化钠溶液，振荡涡旋2 min，于4 000 r·min-1离心机中离心8 min，取上清液，重复提取1 次，上清液合并。加5 mL 正己烷，振荡涡旋1 min，于2 000 r·min-1离心8 min，丢弃上层液，重复处理1 次。加5 mL（水饱和的）乙酸乙酯，振荡涡旋1 min，2 000 r·min-1离心8 min。上层液转移至新的15 mL 离心管，水饱和的乙酸乙酯重复提取1 次，提取液合并，用氮气吹干，加入3 mL 水-乙腈（95 ∶5，v/v）溶解，备用。

取C18固相萃取柱，依次用10 mL 甲醇、10 mL 水预洗。取备用液过柱，加3 mL 水洗柱，重复1 次，加4 mL 甲醇-水（50 ∶50，v/v），以1 mL·min-1的速度进行洗脱，用15 mL 离心管收集洗脱液。加4 mL 水饱和乙酸乙酯，振荡涡旋1 min，于2 000 r·min-1离心机离心5 min，取上层液，加4 mL 水饱和乙酸乙酯重复处理1 次，上层溶液合并，氮气吹干。加1 mL 甲醇-水（50 ∶50，v/v）溶解，取上清液过0.22 μm 滤膜后上机分析。

1.4 标准系列溶液配制

氯霉素标准储备液：准确称取10 mg 氯霉素，用甲醇稀释、定容至100 mL 容量瓶中，摇匀，配制成100 μg·mL-1的标准储备液。

氯霉素标准工作液：准确量取适量氯霉素标准储备液，用甲醇-水（50 ∶50）分别稀释成浓度为100 ng·mL-1、50 ng·mL-1和10 ng·mL-1的标准工作液。

氯霉素内标工作液：准确量取适量氯霉素-D5原液，用甲醇-水（50 ∶50）稀释成浓度为20 ng·mL-1的内标工作液。

标准系列溶液：用流动相配制成浓度为 0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1，内标浓度为5 ng·mL-1的标准系列溶液，详见表1。

表1 标准溶液配制表（单位：μL）

1.5 仪器分析条件

1.5.1 液相色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD Silica（2.1 mm×100.0 mm，1.9 μm）；柱温：35 ℃；流速：0.3 mL·min-1；进样量：2 μL。流动相：甲醇（A）+水（B），梯度洗脱程序见表2。

表2 梯度洗脱程序表

1.5.2 质谱工作条件

离子源：H-ESI；离子模式：负离子；扫描模式：多重反应监测（MRM）；离子源温度：350 ℃；鞘气：35 arb；离子转移管温度：300 ℃；辅助气：8 arb；尾气：0 arb；监测离子参数情况见表3。

表3 氯霉素特征离子质谱条件表

2 结果与分析

2.1 方法的线性关系

将配制的标准系列溶液在1.5 仪器条件下上机测试，以特征离子质量色谱峰外标与内标峰面积的比值为纵坐标，相对应的标准溶液的浓度点作为横坐标，采用色谱工作站自动拟合标准工作曲线，线性回归方程为y=0.199 8x+0.483 9，相关系数为0.999。结果表明，氯霉素在0.5 ～20.0 ng·mL-1线性关系良好，见图1 相关系数R大于0.995，满足相关标准对线性关系的规定。

图1 氯霉素标准工作曲线图

2.2 检出限与定量限

称取5.00 g 阴性猪肉，加入0.01 mL 浓度为 0.5 μg·kg-1氯霉素标准溶液（即加入量为0.1 μg·kg-1），按照1.3 试样处理过程、1.5 仪器条件分析测定，测得氯霉素的信噪比S/N为683.98，大于3.0，本方法中氯霉素的检出限为0.1 μg·kg-1；称取5.00 g 阴性猪肉，加入0.02 mL 浓度为0.5 μg·kg-1氯霉素标准溶液（即加入量为0.2 μg·kg-1），按照1.3 试样处理过程、1.5 仪器条件分析测定，测得氯霉素的信噪比S/N为3 453.11，大于10.0，本方法中氯霉素的定量限为 0.2 μg·kg-1，检出限与定量限均满足标准相关要求。

2.3 加标回收率及精密度

称取阴性猪肉样品，分别添加低（0.20 μg·kg-1）、中（1.00 μg·kg-1）、高（2.00 μg·kg-1）3 个浓度水平的氯霉素标准溶液，按照1.3 试样处理过程、1.5 仪器分析条件将各浓度水平平行测定6 次，考察方法的加标回收情况与精密度（以相对标准偏差RSD 表示），试验结果见表4。氯霉素在0.20 ～2.00 μg·kg-1添加水平下，回收率在72.2%～109.0%，相对标准偏差RSD 在1.7%～7.1%，回收率与精密度均符合方法标准规定。

表4 加标回收率与精密度试验结果

3 结论

本研究参照GB 31658.2—2021 建立了液相色谱-串联质谱法测定猪肉中氯霉素残留量的分析方法，该方法前处理过程简便、分离效果好、分析速度快，可进行准确定性定量分析，经过方法学验证，该方法线性关系良好，检出限与定量限、加标回收情况及方法精密度都满足相关标准的规定，可满足食品检验检测机构对猪肉中氯霉素残留的批量快速检测需求。