猕猴属（Macaca）动物人工授精技术研究进展

孙晨皓，罗 婷，马海东，程 佳，路宏朝，张 涛，曾文先

（陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001）

非人灵长类动物（non-human primates，NHPs）的基因组和生理结构最接近人类，且规避了伦理的限制［1］，使其在生物医学和生命科学实验中具有不可替代性。猕猴属（Macaca）隶属灵长目猴科，其下分为22个种，包括恒河猴（Macaca mulatta）、食蟹猴（Macaca fascicularis）和藏酋猴（Macaca thibetana）等［2］，目前常用的实验猴主要为恒河猴和食蟹猴。我国是野生灵长类动物分布较为丰富的国家之一，猕猴属动物的人工饲养也在迅速发展［3］；但近年来随着生物制药的热度越来越高，以及在新冠病毒肆虐全球的严峻形势下，全球制药企业及科研机构对于非人灵长类实验动物旺盛的需求导致实验猴供应紧张。自然条件下猕猴属动物性成熟年龄为3～4岁，孕期约6个月，自然妊娠率低，且基本上为一年一胎，恒河猴繁殖有较明显的季节性，但食蟹猴繁殖不具有季节性［4-6］。猕猴属动物种群数量很难满足现在的市场需求，因此人工授精技术显得尤为重要。人工授精（artificial insemination，AI）是较为简单的辅助生殖技术，将新鲜精子、冷冻保存解冻后的精子或附睾精子转移到雌性生殖道中。AI在包括人类在内的许多哺乳动物繁殖中取得了成功，但在猕猴属动物中应用较少，从侧面反应出猕猴属动物研究成本昂贵及其特殊性。为提高实验动物的利用率和降低成本，可使用冷冻精子完成AI，精子冷冻保存也可以保存种质资源，跨越时间和空间的限制，提供稳定且质量较好的精子，待需要时解冻精子。

1 精子的采集

人工授精技术的第一步是精子的采集。猕猴属动物的采精方法有阴茎电刺激法（penile electrical stimulation method，PEM）［7-9］和直肠探头电刺激法（rectal probe electrical stimulus method，REM）［10-13］等。相较于阴茎电刺激法，REM操作步骤较繁琐，且电压是否灼伤直肠不易观察，同时有研究表明REM收集的精子样本质量不如PEM［14］，因此猕猴属动物采集精子多使用PEM。

用于冷冻保存的精子样本应满足精子活力≥70%［15］，精子密度调整范围5.0～10.0×107个／mL［16］。采精不宜过于频繁，同一只公猴一周采集不应超过2次。电刺激法可能诱使公猴出现自淫现象，若发现有自淫现象应及时调换实验动物，以避免影响后续精子样本质量。

2 精子的冷冻保存

精子可在超低温下长期保存，但在冷冻和解冻复苏的过程中会对精子细胞造成一定程度的损伤。冷冻损伤可能的机制有冷休克、冰晶形成、渗透压应激［17-18］和氧化应激［19］等，但其具体机制仍不完全清楚。精子冷冻保存涉及一系列连续步骤，每一步都与解冻后的精子质量息息相关，因此应探寻最适用于猴精子的冷冻保存液和冷冻保存步骤以提高冷冻后的精子质量。

2.1 精子密度

L.T.Denis等［20］对松鼠猴的研究表明，精子浓度可能影响解冻后精子的质量。Dong Q.等［16］研究表明，在较高密度下冷冻保存恒河猴精子，解冻后的精子活率较高。建议恒河猴精子冷冻保存时将精子浓度调整为（5.0～10.0）×107个／mL。

2.2 冷冻保存稀释液液成分

因暂无商业化的猴精子冷冻保存稀释液，冷冻保存稀释液多现配现用。常用的两种基础液是TTE（Tes-Tris-egg yolk）稀释液［15，21-22］和TCG（Triscitric acid-glucose）稀释液添加卵黄［23］。

2.2.1 精子冷冻保存液中糖的作用 作为精子能量代谢的底物，糖通过糖酵解途径或者三羧酸循环分解产生ATP，为精子提供能量，同时也调节稀释液的渗透压［24］。SiW.等［25］对比单独或联合添加葡萄糖（单糖）、乳糖（双糖）和棉籽糖（三糖）对恒河猴精子冷冻和解冻过程中精子质量的影响，发现多种糖联合使用能比单独使用棉籽糖具有更好的保护作用，低浓度（0.15 mol／L）时，葡萄糖和棉籽糖联合使用比乳糖和棉籽糖提供更好的保护效果。最近有研究发现，糖酵解过程中产生的副产物甲基乙二醛（methylglyoxal）会对细胞产生毒性作用，且甲基乙二醛的产生与葡萄糖浓度成正比［26-27］。冷冻保存稀释液中低浓度的葡萄糖可能产生更少的甲基乙二醛，有利于种马精子的冷冻保存［28］。由于不同物种间的差异性较大，糖毒性作用是否适用于猕猴属动物精子还需进一步探索。

近年来，冷冻保护液中添加海藻糖（trehalose）的研究越来越多。海藻糖是一种天然的非渗透性双糖，在精子冷冻保存过程中一方面提供高渗环境，在冷冻操作前使细胞适度脱水，可减少细胞内冰晶的形成［29-31］；另一方面通过与膜磷脂反应并使细胞膜更快地降到玻璃化转变温度，稳定膜的完整性和顶体 状 态［31-33］。目 前 研 究 者 已 在 猪［34］、羊［31，35］、兔［36］和牛［37］等动物精子稀释液中添加一定浓度的海藻糖，均可减少冻后精子细胞膜和顶体的损伤，但未在猕猴属动物精子冷冻保存中验证。

2.2.2 动物源蛋白的添加 自从研究者发现卵黄有利于维持公牛精子功能与结构的完整性［38］之后，在动物精子冷冻保存稀释液中通常添加卵黄。卵黄对精子的保护机制尚不完全明确，有学者推测低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）可能是提供保护的主要成分［39-41］。LDL有两方面作用：一方面可以结合或附着在精子膜上，在精子膜表面形成保护膜［42］或取代已丢失的磷脂［43-44］；另一方面LDL可能通过减少精浆中脂结合蛋白对精子膜的有害影响而间接保护精子［45］。精浆中存在一些脂结合蛋白，可与精子膜结合，导致胆固醇和磷脂外流［46-47］，进而降低精子在冷冻保存过程中的抗打击能力。但在恒河猴的精子冷冻保存过程中发现，精子在精浆中存留5 h不会降低精子冷冻后的活率，推测卵黄对恒河猴精子冷冻可能有其他保护机制［48］。

卵黄的成分复杂，含有很多未知的化合物，而且可能带有禽类的病原微生物，有疾病传播的风险，因此需要研发不添加卵黄的稀释液。Dong Q.等［48］研究表明，冷冻保护剂中添加不同浓度卵黄对恒河猴精子解冻后的质量并无显著影响，但添加组均高于不添加组。Yan Y.P.等［49］和陈衍等［50］研究使用不含卵黄的人用精子冷冻保存液，成功保存了食蟹猴精子，但与含卵黄冷冻保存液相比精子冻后活率较低。

除卵黄外，也有研究在马、牛和山羊等的精子冷冻保存液中添加脱脂牛奶［45］，但牛奶对精子具体的保护机制仍不清楚。抗冻蛋白（antifreeze protein，AFP）可以减少冰晶的形成和精子复苏时水重结晶的形成［51］，Wang S.N.等［52］报道，在食蟹猴精子冷冻保存研究中用AFPⅢ代替卵黄是可行的，但高浓度AFPⅢ（100μg／mL）对精子顶体完整性有不利影响，其具体影响机制尚不清楚。

2.2.3 渗透性抗冻剂的作用 甘油、二甲基亚砜、乙二醇和丙二醇等都是渗透性抗冻剂。有研究表明乙二醇在精子冷冻保存过程中发挥的作用与甘油相当［23，53］，但二甲基亚砜不适用于猕猴精子的冷冻保存［54］。Li Y.H.等［15］的研究对比了不同甘油浓度（1%、3%、5%、10%和15%）和平衡时间（10，30，60，90 min）对精子活率和精子细胞膜完整性的影响，结果表明，添加5%甘油并平衡30 min，解冻后精子活力和精子细胞膜完整性最高。其他研究也表明甘油的最适添加浓度为3%或5%［21-22，55］。加入甘油时的温度、冷冻降温速率和稀释液其他成分等也影响冷冻效果，因此不同稀释液或不同冷冻降温程序选择的甘油浓度可能不同。

由于甘油等渗透性抗冻剂对精子也可能造成损害［56-57］，因此考虑是否能不加入抗冻剂。Dong Q.等［58］首次证明，在不含甘油或乙二醇等冷冻保护剂的情况下可以成功冷冻保存猕猴精子，但解冻后的精子活率较添加甘油差。因此，还需进一步优化稀释液配方，如加入抗冻蛋白等替代抗冻剂的作用。

2.2.4 抗氧化剂的作用 精子在降温、冷冻和解冻过程中活性氧（ROS）不断累积，而过量ROS会导致氧化应激，对恒河猴精子产生不利的影响［59］，引起精子DNA损伤［60］。因此，可在冷冻保存液中添加抗氧化剂，以弥补精子自身自由基清除系统的有限性［61-62］，改善冻后精子的质量。根据抗氧化剂的化学结构，可将其分为酶类和非酶类［63］，其中常见的酶类抗氧化剂有谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶；非酶类抗氧化剂有自由基清除剂，如维生素E（α-生育酚）、维生素C（抗坏血酸）、褪黑素和L-肉碱等［64-65］。猕猴属动物精子冷冻保护液中抗氧化剂的添加鲜有报道，将来应更深入探究添加不同抗氧化剂的冷冻保存液对猕猴属动物精子冻后质量的影响。

2.3 精子冷冻程序

甘油只需要几秒钟就能渗透到精子细胞［66］，加入甘油后的平衡时间较为重要。F.Cho等［67］在稀释液中加入甘油，对比甘油未平衡和平衡0.5 h的效果，发现未平衡组精子冷冻后活率更低。有研究对比恒河猴精子冷冻保存前在4℃中预冷与不预冷时精子解冻后的活率，结果预冷组有小幅度提高［16］。从精子对降温的适应来说，建议加入预冷这一步骤。

目前，猕猴属动物的精子冷冻程序基本上与T.L.Tollner等［22］的报道相似，即采用缓慢的冷却和快速冷冻相结合，先用稀释液将精子第一次稀释，然后置于4℃冷却室中预冷2～4 h［68］；再添加含冷冻保护剂的稀释液进行第2次稀释，装入塑料细管，平衡后置于液氮蒸气上熏蒸10 min，最后放入液氮中保存。由于熏蒸时距液氮面的高度及液氮容器大小等均影响冷冻效果、实验人员的操作误差，难于标准化制作冷冻精子，优先考虑用程序降温仪冷冻精子［52］。

3 人工输精

猕猴属动物子宫颈管的结构较为复杂，属内不同种间的结构也存在差异，如恒河猴子宫颈管呈“S”形，食蟹猴子宫颈管虽没有恒河猴那么弯曲，但子宫颈管处具有较深的隐窝等［69-70］，使得猕猴属动物的人工输精比较困难，无法直接使输精器达到宫腔内。一般精子是从雌性生殖道探入宫腔内［71-73］，也可以在B超引导下通过腹壁穿刺将精子直接注射到子宫腔内［74-75］，但该腹壁穿刺输精对实验人员的操作要求较高。

食蟹猴月经周期与人类相似，也可分为月经期、卵泡期、排卵期和黄体期，但因为个体差异，周期长短不同［76］。输精时间应选择在排卵前，一般在月经周期的8～15 d［77］。其具体排卵期还应结合生殖激素测定，如雌二醇、促黄体生成素、孕酮等［68，73］或B超观察卵泡发育情况判断。另外，一些研究人员通过阴道涂片法［78］和基础体温／体重［79］判断排卵日期，但这两种方法收集数据较困难，准确性较差，不宜作为常规判断排卵期的方法使用。

4 小结及展望

随着疾病治疗药物开发需求的增加，对猕猴属实验动物的需求量随之增加。通过人工授精技术增加种群数量，有助于减少实验猴供应的压力。目前人工授精的难点在于精子冷冻保存，包括精子冷冻保存稀释液成分的选择和冷冻程序。使用冷冻精子有助于提高实验动物的利用率，改善雄性动物的福利，并保护濒危的物种。目前猕猴属动物精子冷冻保存研究取得了一定的进展，但是研究还不深入。精子冷冻后活率低、受孕率低，还需继续改良猕猴属动物精子冷冻保存液配方，如不同糖对精子的保护作用、动物源蛋白对精子的具体保护机制、植物源蛋白是否可以替代动物源蛋白和冷冻保存液中抗氧化剂的添加等；尝试开发适用于猕猴属动物的商业化精子冷冻保存剂；继续优化冷冻保存程序，如甘油的添加方式和时间、精子预冷及复苏时间等，从而最大程度地利用好优秀的种质资源。