外泌体在食管癌诊治中的研究进展▲

吴发胜 李建福 陈 慧 谢家童 张 晖 周尧红

(1 广西中医药大学附属瑞康医院放疗科，广西南宁市 530011；2 广西中医药大学研究生院，广西南宁市 530001)

【提要】 在我国，食管癌已经成为一种高发病率、高致死率的消化道恶性肿瘤，其发生和发展受到多种因素的影响。外泌体是一种纳米级的微囊，含有多种成分，是细胞之间和组织之间信号传递的重要介质。本研究总结近年来有关外泌体诊治食管癌的研究进展，探讨外泌体对食管癌的调控机制及其临床应用价值，对外泌体用于食管癌的诊断及治疗作用提出展望，以期为食管癌的诊疗提供新的策略。

食管癌是影响人类健康的主要恶性肿瘤之一。据统计，2018年中国新增食管癌患者307 359例，新增死亡患者283 433例，食管癌的患病率、病死率在全球癌症中分别位居第七位和第六位[1]，食管癌患者的5年总生存率为20%～30%[2]。食管癌的临床症状包括吞咽异物感、吞咽困难、胸骨后疼痛等，在组织学上可分为鳞癌和腺癌，我国食管癌患者主要以鳞状细胞癌为主，而欧美国家患者以腺癌为主[3]。由于食管癌起病隐匿，早期多无明显症状，所以大多数食管癌患者在就诊时其病情常已处于晚期，这使得该病的治疗面临极大的挑战[4]。目前，食管癌的治疗方法主要有手术治疗、放射治疗、药物治疗和联合治疗等，其中药物治疗主要包括新辅助化疗、辅助化疗、中医药治疗，以及近年来出现的分子靶向治疗和免疫治疗等[5]。外泌体是包含蛋白质、脂类、核酸等多种成分的小膜泡，目前被认为是一种特殊的分泌膜泡。有研究显示，外泌体在肿瘤的生长过程中扮演了重要角色，其参与了食管癌细胞的存活、增殖、迁移、侵袭及微环境的构成，并在食管癌的诊断和治疗中具有重要价值[6]。本文就外泌体在食管癌的发生及发展、诊断及治疗中的作用展开综述，以期突破目前食管癌的治疗瓶颈。

1 外泌体概述

20世纪70年代Rose Johnstone首次提出外泌体是网织红细胞在成熟过程中分泌的小泡，并将其视为参与分子废物排泄的囊泡[7]。随后，研究发现外泌体广泛存在于生物的体液中，且在体内具有多种生理功能并参与多种病理过程[8]。外泌体具有脂质双层膜结构，大小在30～150 nm之间[9]，密度在1.13～1.19 g/mL之间[10]，其囊泡内包含核酸、脂质、多肽等，是细胞之间联系的纽带[11]。外泌体有固定的信号通路，其在产生、分泌、运输、吸收、释放过程中参与了人体的生理和病理过程[12-13]。研究表明外泌体在癌症的发生、发展及药物治疗中具有重要的作用，对外泌体进行深入的研究可为肿瘤的诊断及治疗提供新思路[14]。

2 外泌体参与食管癌的发生和发展过程

2.1 促进食管癌细胞的增殖 有研究发现，外泌体参与食管癌多个信号通路的传导，在癌细胞的生长中有着重要作用[15]。miRNA是一种包含19～25个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子，肿瘤细胞可以释放出多种含有miRNA的外泌体，刺激肿瘤细胞在微环境中转移，源于外泌体的miRNA在人类肿瘤的发生和发展中起着关键作用[15]。Liu等[16]发现外泌体来源的miR-95-5p通过其功能靶基因磷酸酶-张力蛋白同源性基因影响其下游蛋白的表达，从而在肿瘤的微环境中促进食管癌细胞的增殖。还有研究显示，食管癌组织中miR-28-5p的表达水平高于癌旁组织，且miR-28-5p可以促进食管癌细胞的增殖，其机制可能是miR-28-5p通过降低转移抑制因子-1的表达，从而诱导细胞增殖，进而促进食管癌的发展[17]。外泌体来源的长链非编码RNA在食管癌的生物学过程中也是一种很重要的基因调控因子，相关研究表明LINC00885在食管癌组织中高表达，其可以促进食管癌细胞的增殖[18]。Shi等[19]的研究证实LINC00337也可以促进食管癌细胞的增殖，并在食管癌中充当肿瘤启动子。

2.2 介导食管癌细胞的迁移与侵袭 外泌体可通过细胞膜渗透到细胞中，促进癌细胞的迁移、侵袭。肿瘤细胞外泌体含多种基质金属蛋白酶，其可通过降解细胞外基质及剪切细胞黏附分子，从而促进肿瘤细胞的侵袭转移[20]。Khazaei等[21]的研究显示，外泌体来源的miR-451是癌症相关成纤维细胞的信号分子，为癌细胞的迁移及肿瘤的发生发展创造了条件。由此可见，外泌体在食管癌细胞的迁移和侵袭中起关键的作用，是食管癌发展的重要因素。

2.3 参与食管癌微环境的构成 肿瘤微环境与肿瘤的发生密切相关，在肿瘤微环境中除了肿瘤细胞，还有淋巴细胞、树突状细胞、肿瘤血管及成纤维细胞等，这些非恶性细胞在受到刺激及失控状态下大量增殖，参与癌变的各个阶段[22]。癌细胞与周围细胞之间的联系是双向的，微环境中细胞之间的联系主要通过黏附分子、电偶联和缝隙连接进行，但细胞因子、生长因子和外泌体的经典旁分泌信号也参与细胞之间的生物学过程[23]。血管生成是恶性肿瘤进展的重要因素，相关研究表明，肿瘤外泌体可能通过调控血管内皮生长因子和趋化因子受体信号途径，增强血管生成和肿瘤生长能力[24]。还有学者发现，肿瘤细胞来源的外泌体可以与各种免疫细胞之间的相互作用，抑制自然杀伤细胞和效应T淋巴细胞的活化，并促进调节性T淋巴细胞、调节性B淋巴细胞增殖，使免疫抑制性肿瘤微环境形成[25]。阻断外泌体介导的免疫抑制性肿瘤微环境的形成可能是肿瘤治疗的新方向。

3 外泌体在食管癌诊断中的应用价值

食管癌早期没有特异性表现，患者常因诊断延误而错过最佳治疗期，早期诊断成为治疗食管癌的关键。为此，越来越多的研究者试图寻找可以诊断肿瘤的标志物。在生理环境下广泛存在，且能使其荷载物稳定保存的外泌体成为了研究指标之一[26]。外泌体中的miRNA具有多样性和特异性，例如食管鳞状细胞癌患者血清外泌体中的miRNA-21表达量增加，而前列腺癌患者血清外泌体miRNA-141呈高表达[27]。同时，外泌体的蛋白可能反映其细胞起源，也有助于肿瘤的诊断。例如，黑色素瘤患者与健康对照相比，其外周循环外泌体中的MET和MET磷酸化表达增加[27]。

有研究发现，食管癌患者血清外泌体中的miR-1246表达水平高于健康对照组，在手术切除肿瘤后，其表达水平降低；受试者工作特征曲线分析显示，血清外泌体中的miR-1246诊断食管癌患者的敏感性和特异性分别为71.3%和73.9%；血清外泌体中的miR-1246与食管癌患者肿瘤淋巴结转移期显著相关[28]。有学者在人食管癌细胞和裸鼠食管癌细胞移植瘤中检测到唾液外泌体高尔基体膜蛋白1-N-α-乙酰转移酶35嵌合体RNA(Golgi membrane protein 1-N-alpha acetyltransferases 35 chimeric RNA,G-NchiRNA)的表达，唾液外泌体G-NchiRNA水平可以反映肿瘤负荷[29]。这提示唾液外泌体G-NchiRNA或可作为诊断食管癌的一种生物标志物。

4 外泌体在食管癌治疗中的作用

4.1 免疫治疗 随着研究的不断深入，免疫疗法在肿瘤治疗中广泛应用，为癌症患者带来了新的希望。外泌体可通过增强抗原递呈或直接激活免疫细胞加强免疫应答，从而发挥抗肿瘤免疫效应。孔祥伟等[30]采用Western blot检测人间充质干细胞来源的外泌体中相关蛋白的表达情况，发现外泌体中CD63、CD81呈阳性表达，初步证明人间充质干细胞的外泌体有免疫调节功能。Romagnoli等[31]发现，将T淋巴细胞与经树突状细胞外泌体处理的肿瘤细胞一起培养，T淋巴细胞显示出更高的γ干扰素分泌率，这表明在肿瘤细胞中加入外泌体可增强其激活T淋巴细胞的能力。Li等[32]研究发现，外泌体中的脆性X信使核糖核蛋白1-反义RNA1(fragile X messenger ribonucleoprotein 1-antisense RNA1,FMR1-AS1)在食管癌患者中存在特异性表达，且肿瘤微环境中也可以检测到外泌体FMR1-AS1，血清外泌体中的FMR1-AS1水平与患者的生存期存在一定的关联，外泌体中的FMR1-AS1可通过激活Toll样受体7-核因子κB信号通路，上调受体细胞中的c-Myc癌基因水平，激活机体免疫。因此，外泌体中的FMR1-AS1有希望成为治疗食管癌患者的靶点之一。

4.2 药物载体 外泌体是一种可以介导细胞间信息交换和物质运输的介质，其可作为药物的载体。如Wang等[33]将M1极化巨噬细胞来源的外泌体(M1-polarized macrophage-derived exosome,M1-Exos)作为紫杉醇(paceitaxel,PTX)的药物载体，采用MTT法和流式细胞仪检测PTX-M1-Exos对小鼠乳腺癌细胞4T1的杀伤作用，并采用荷瘤小鼠进行体内实验，结果显示M1-Exos可作为载体将PTX导入肿瘤组织中，增强化疗药物对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用。此外，血清中的外泌体也可作为药物的载体。Yu等[34]在多种外泌体中加载荧光染料后将其通过皮下注射至小鼠体内，检查外泌体在淋巴结中的积累情况，发现胎牛血清来源的外泌体可以作为免疫刺激剂的载体进入淋巴结，其被运输到淋巴结的表面区(包膜下窦的巨噬细胞区)和淋巴结的内侧副皮质区(T淋巴细胞区)，从而将免疫刺激分子有效地输送到抗原提呈细胞和T淋巴细胞，在免疫刺激生物分子的激活下细胞因子γ干扰素和肿瘤坏死因子α诱导CD3+T淋巴细胞的作用增强。

4.3 肿瘤疫苗 肿瘤组织的外泌体大多都有其特定的肿瘤抗原，因此，外泌体用于疫苗的研发也成为研究的热点。1998年，Zitvogel等[35]首次使用树突状细胞来源的外泌体作为肿瘤疫苗，并用于动物模型，发现该疫苗可以激活特异性细胞毒性T淋巴细胞以发挥抗肿瘤作用。有学者发现，从冷冻脐带血单核细胞来源的树突状细胞中分离得到的外泌体可诱导肿瘤排斥反应，与基于细胞的免疫疗法相比具有明显的优势，对癌细胞有较强的杀伤活性[36]。而冷冻脐血单核细胞容易获得，故其外泌体有望成为制备肿瘤疫苗的原材料。有研究发现，给予食管癌模型小鼠一种食管癌选择性树突状细胞外泌体疫苗，可有效抑制肿瘤生长并延长小鼠的生存时间[37]。该疫苗通过刺激食管癌模型小鼠的免疫系统重塑了肿瘤免疫微环境，并通过CD8+T淋巴细胞依赖机制发挥免疫治疗作用[37]。由此可见外泌体疫苗为食管癌提供了新的治疗方案。

4.4 与中医药的联合应用 近年来，中医药抗肿瘤的临床试验和基础实验研究有较大的进展，中医药联合手术、放化疗、靶向治疗等在食管癌的治疗中具有独特的优势。无论是单味中药或是复方中药，都可以多靶点、多途径地参与肿瘤的治疗，而中药可以通过调控外泌体来发挥其靶向调控、远距离传输的治疗作用[38]。陈玉龙[39]研究发现，将食管癌 EC9706 细胞与脐静脉内皮细胞分泌的外泌体共培养后，EC9706 细胞对顺铂的耐药性有所增加，其机制与脐静脉内皮细胞外泌体中miR-21的表达上调有关；启膈散是中医行气化痰的代表方，启膈散含药血清可以增加食管癌细胞EC9706对顺铂的敏感性，从而增强顺铂致细胞的凋亡效应，其机制与启膈散含药血清降低脐静脉内皮细胞外泌体中miR-21的表达，上调miR-21靶分子程序性细胞死亡蛋白4、磷酸酶-张力蛋白同源性基因表达有关。还有研究发现，中药植物外泌体含有的miRNA可以利用外泌体作为载体来调控其他物种的基因表达，以达到抗肿瘤的目的[40]。治疗肿瘤的中药存在有效成分溶解度低、生物利用度低等问题，而外泌体作为新型药物载体，可以更好地将中药有效成分递送至靶细胞。有学者认为利用自源性外泌体作为中药的载体具有良好的生物相容性与非免疫原性，可以提高药物的有效利用率，降低药物成分的清除率[41]，从而使中药发挥更好的抗肿瘤作用。

5 展 望

外泌体参与了食管癌的发生和发展，研究其作用机理可为外泌体诊治食管癌提供理论依据，但有关外泌体的研究正处于起步阶段，其在肿瘤中的作用机制尚不清楚，且人工合成外泌体的技术尚未成熟，如何精准制订外泌体治疗肿瘤的方案还有待深入研究。