Keap1/Nrf2在非小细胞肺癌治疗抵抗中的作用

高 萌 翟乃亮

滨州医学院第一临床医学院呼吸内科 山东 滨州 256603

肺癌目前是肿瘤相关死亡的首要原因，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者的5年生存率仅为26%，而存在转移的患者存活率更低，仅为6%，晚期的NSCLC患者可以通过放化疗相结合的方式来延长生存时间，靶向治疗和各种免疫疗法的应用，在临床上取得了实质性的进展[1]。但是NSCLC平均非同义突变负担很高，仅有部分患者可以从靶向治疗中获益，酪氨酸激酶抑制剂及免疫治疗药物耐药后治疗方案的选择非常困难，部分患者甚至会在免疫治疗后出现过度进展[2-3]，因此晚期NSCLC及耐药患者的治疗是目前临床上的难点和热点。

核转录因子红系2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)是氧化应激过程中的重要因子之一，在蛋白水平上接受Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)调控，通过维持氧化还原动态平衡，发挥抗炎及抗癌活性。但是Keap1/Nrf2途径可以被肿瘤细胞劫持，一方面可以引起肿瘤的生长和侵袭性增加，另一方面肿瘤细胞可以利用Nrf2介导的解毒机制引起治疗抵抗。在NSCLC中，Keap1/Nrf2突变在驱动基因阴性的腺癌中富集，也与EGFR、KRAS、STK11(LKB1)、TP53等基因突变密切相关。携带Keap1/Nrf2突变的NSCLC患者多存在转移[4-5]。Tsakonas等[6]研究提出Nrf2+/CK+细胞密度高的NSCLC患者早期中枢神经系统转移风险更高。Nrf2及其相关通路异常与晚期NSCLC放化疗抵抗、免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICIs)及酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)耐药密切相关，成为NSCLC一种特殊的临床表型[5-7]。本文主要探讨了Keap1/Nrf2通路的理论基础及Nrf2在肺癌治疗抵抗中的研究进展，为NSCLC的治疗探索新的方向。

1 Keap1/Nrf2信号通路

Nrf2是1994年Moi等人利用串联重复序列作为识别位点探针从K562细胞中筛选Agtll cDNA 表达文库分离出来的DNA结合蛋白之一，其由Nfe2l2基因编码，属于bZIP碱性亮氨酸拉链(CNCbZIP)转录因子家族，由7个功能结构域(Neh1～Neh7)组成，其中Neh1与v-MAF禽肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物或Jun蛋白(c-Jun，Jun-B和Jun-D)二聚化后激活一系列含有抗氧化反应原件(antioxidant reaction elements，ARE)或者电泳体反应原件的基因，行使生物功能[7]。这些下游基因可以分为三类：细胞内氧化还原平衡蛋白如谷氨酸-半胱氨酸连接酶、血红素加氧酶-1，外源代谢酶NAD、NAD(P)H-醌氧化还原酶1以及转运蛋白如多药耐药相关蛋白等，参与多种细胞过程，如DNA修复、蛋白酶体组装、转录调控、细胞凋亡、细胞自噬、氧化还原调节、脂质/碳水化合物代谢、铁和血红素代谢等[8]。

在正常条件下，Nrf2通过其Neh2结构域中的ETGE和DLG基序与两个Keap1锚定于肌动蛋白细胞骨架、富含半胱氨酸的蛋白分子相互作用，引起自身的泛素化。泛素化的Nrf2可以被26S蛋白酶体迅速降解，在细胞质中维持在很低的水平[4]。负责Nrf2泛素化的主要有三种泛素连接酶复合物：CUL3-RBX1-Keap1、非Keap1依赖的SCF/β-TrCP和HMG-CoA还原酶降解蛋白(HMG-CoA reductase degrades protein，HRD1)。在这三种方式中，CUL3-RBX1-Keap1对于胞质中的氧化/亲电反应更为敏感，CUL3作为支架蛋白，与Keap1的BTB结构域结合，允许与E2泛素结合酶形成复合物，对CUL3的类泛素化修饰也可以引起Nrf2在细胞中的积累；β-TrCP与Neh6结合，在胞核或胞质中发挥作用，对代谢变化更敏感，并受GSK3-β调节；HRD1局限于内质网，并且仅在ER应激期间发挥作用[7-8]。

当细胞暴露于氧化应激以及化学预防化合物中状态下,亲电体及ROS就会与传感器半胱氨酸反应，影响其构象，避免了Nrf2被蛋白酶体系统降解，并且不同的化学物质可以靶向不同的半胱氨酸残基，进而形成“半胱氨酸密码”的概念。除此之外，含ETGE蛋白的竞争性结合、蛋白-蛋白相互作用抑制剂、p62/SQSTM1水平升高、mTOR抑制剂和CUL3环E3连接酶抑制剂(即MLN4924)都可以破坏KEAP1-NRF2相互作用[9]。在NSCLC中，Keap1和Nfe2l2的突变通常是互相排斥的，Keap1突变体还会出现显性-负性效应，即突变的Keap1蛋白会对野生型Keap1蛋白质产生负面影响[9]。

2 Keap1/Nrf2通路与NCLC治疗抵抗

2.1 Keap1/Nrf2与化疗 先前已有研究证实应用RNAi沉默Nrf2可以提高NSCLC细胞对于化疗药物的敏感性，抑制Nrf2是对抗NSCLC化疗耐药的方式之一[6]。

Nrf2天然抑制剂以鸦胆子苦醇(Brusatol)为代表，还包括雷公藤甲素、胡芦巴碱以及银杏黄酮等多种药物。在A549异种移植瘤中，Brusatol联合顺铂引起的治疗增敏是通过增强泛素化促进Nrf2降解，与Keap1的异位表达并无明显相关性，但后续研究发现在A549细胞蛋白质组中，Brusatol可以迅速且有效的降低Nrf2以外的某些半衰期较短的蛋白质，并且还可以调节核糖体复合体的功能，这种作用类似于蛋白质翻译抑制剂，提示Brusatol抑制Nrf2的作用缺乏特异性[13]。雷公藤甲素在A549细胞以及移植瘤中可通过影响Nrf2-AREs途径使Nrf2在mRNA和蛋白水平上的显著减少，提高化疗敏感性，并且在低浓度即可有效抑制A549细胞生长，在无毒水平上可以有效靶向Nrf2途径[14]。胡芦巴碱通过抑制EGFR信号通路及其下游效应因子ERK1/2激酶来抑制Nrf2的激活及核转位，对抗顺铂诱导的EGFR磷酸化及Nrf2激活，改善化疗疗效[15]，作用机制类似的还有二甲双胍[16]。银杏黄酮是通过使Nrf2/血红素加氧酶-1轴的失活触发细胞铁死亡以及促进顺铂诱导的线粒体膜丢失和细胞凋亡，增强顺铂疗效[17]。Nrf2天然抑制剂的特异性较差，Singh等[18]通过高通量筛选方式选定的ML385对Keap1突变导致Nrf2功能增强的NSCLC细胞具有较强的特异性和选择性，通过与Nrf2的N端碱性亮氨酸拉链结构域Neh1结合，干扰MAFG-Nrf2蛋白复合物与所调节的DNA序列的结合，增强化疗药物的细胞毒性，并且在原位NSCLC临床前模型中ML385与卡铂双药联合有显著疗效。

Keap1/TP53双突变的肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)与TP53单突变的肿瘤预后相似，Keap1单突变体的LUAD患者存活时间最短[9]，TUNG等的研究表明突变型P53可能是通过增加Sp1与Nrf2启动子的结合来上调Nrf2转录引起顺铂耐药，且Nrf2、Bcl-2以及Bcl-xl高表达时，顺铂的不良反应更为显著；但Nrf2可以通过促进诸如MDM2基因表达等方式来增加P53降解并影响野生型P53功能，并且MDM2基因可用于P53功能预测，故而野生型P53患者也可存在高Nrf2表达并引起治疗抵抗[19]。RYL-687是一种新的喹诺酮化合物，可以诱导ROS产生和Nrf2上调，从而引起NAD、NAD(P)H-醌氧化还原酶1的升高，并且促进NAD、NAD(P)H-醌氧化还原酶1与P53的物理作用，来抑制20S蛋白酶体对P53的降解[20]。带有死亡结构域的P53诱导蛋白是DNA损伤后p53的主要靶基因，Ji等[10]研究提示，其竞争性地与Keap1结合来减少Nrf2泛素化引起顺铂耐药；但其可以通过形成含有Caspase-2和Raidd的P53诱导蛋白样复合体促进细胞凋亡，引导P53诱导蛋白-Keap1的促凋亡功能是一种新的治疗方向。

应用microRNA或lncRNA靶向Nrf2是近年来新兴的调节方式之一，以miRNA34a及miRNA-495为例，miRNA-34a是Nrf2和Bcl-2的直接抑制物，通过转位至线粒体介导P53下游凋亡效应；通过应用透明质酸纳米颗粒包裹miRNA-34a对顺铂耐药的A549细胞进行转染，引起核DNA及线粒体DNA的表观遗传学状态的改变，将细胞代谢由糖酵解能量代谢转化至线粒体机制，引起氧化应激增加、谷胱甘肽耗竭，诱导凋亡信号及肿瘤细胞死亡[11]。miR-495直接靶向Nrf2的3′-UTR端来影响Nrf2/ARE通路促进顺铂耐药，可以应用lncRNA UCA1作为miRNA-495的“分子海绵”来纠正耐药发生[12]。

2.2 Keap1/Nrf2与放疗 Keap1/Nrf2常引起细胞内ROS减少导致放疗抵抗。肿瘤抑制基因STK11(LKB1)是NSCLC中第二常见的突变基因，LKB1突变的NSCLC细胞中Nrf2活性增强，引起谷氨酸-半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligasecatalytic subunit，GCLC)的上调，催化谷氨酸产生谷胱甘肽，避免了ROS介导的损伤而产生放射抗性，应用GLS抑制剂耗竭谷胱甘肽可以改善放疗敏感性[21]。抑制谷氨酰胺代谢是一种肺癌细胞放疗增敏的有效策略。

Sun等[22]研究提出Nrf2可以通过抗氧化以外的机制来保护细胞DNA。无论存不存在ROS情况下，敲除Nrf2有助于电离辐射(IR)的超敏反应，在清除ROS条件下，DNA双链断裂(DSB)可以增加Nrf2蛋白水平，并诱导Nrf2蛋白募集至与ATR相互作用的DNA损伤位点，激活ATR-CHK1-CDC2信号通路，引起G2细胞周期停滞来促进DSB同源重组修复以保持基因组的稳定性—这是Nrf2作为细胞周期调节因子所发挥的作用。二甲双胍可以针对该途径减少癌细胞的抗氧化能力的同时减少G2细胞周期停滞来对抗放疗耐药，但其体外试验浓度远高于临床药理浓度峰值，其临床意义还有待研究[23]。

2.3 Keap1/Nrf2与免疫治疗 Nrf2的负调控因子Keap1基因突变在小鼠模型中与免疫环境中CD8+T细胞以及NK细胞的低浸润有关，但是晚期LUAD患者Keap1丢失与ICI疗效之间的相关性不明[24]。Ricciuti等[24]研究发现，在KRAS突变联合STK11或Keap1突变的患者中，存在野生型KRAS没有的免疫表型，并且Keap1突变是晚期KRAS突变的LUAD患者中ICIs抵抗的常见的独立因素。KRASMUT/Keap1MUTLUAD显示出I型干扰素和其它炎性细胞因子的正向调节因子下调，如TMEM173(STING)、DDX58、TLR4和TLR7，这与KRASMUT/STK11MUTLUAD的免疫特征不同。

Pten在肺癌中是一种肿瘤抑制因子，其与PI3K通路改变相关。Best等人通过Keap1f/f和Ptenf/f(K1P)小鼠发现Keap1和Pten共缺失可以通过戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway，PPP)重编程促进人肺腺癌形成，并且在Keap1f/f/Ptenf/f荷瘤肺中发现一种免疫抑制微环境，与PD-L1高水平表达相关，且给予抗PD-L1/抗CTLA-4治疗后可以观察到自发性肺肿瘤消退[25]。Shen等[26]研究表明，LKB1(STK11)通过激活AMPK和Keap1/Nrf2信号通路上调NSCLC中PD-L1的表达；LKB1缺失产生的高代谢状态诱导DNA高甲基化，从而进一步沉默依赖于干扰素的基因表达，并且在KRAS驱动的肺癌中建立免疫惰性肿瘤微环境。

Nrf2与NSCLC细胞的免疫环境存在相关性，存在Nrf2激活的LUAD患者，接受抗PD-L1治疗的总体存活率较低；在LUSC中Nrf2的特征状态对免疫或肿瘤细胞的PD-L1表达没有影响，但是Nrf2表达特征与免疫表达特征之间存在负相关，Nrf2低表达的患者在接受阿替唑珠单抗联合化疗治疗的效果优于单独化疗[6]。

Scribble基因是一种抑癌基因，在NSCLC中Scribble水平与Nrf2/PD-L1在体内及体外研究中都表现出负相关，ROS的缺失可以恢复Scribble过表达细胞系中PD-L1的表达。高表达Scribble的患者表现出更好的化疗敏感性，而低表达Scribble的患者会有更高的PD-L1表达，应用PD-1/PD-L1阻断剂对这部分患者是更好的治疗方案[27]。

2.4 Keap1/Nrf2与靶向治疗 Keap1的失活与靶向EGFR、ALK、RTK-RAS-MAPK途径药物敏感性降低有关[9]。Park等[28]通过建立吉非替尼耐药细胞株HCC827GRKU，也获得了对阿法替尼和奥西美替尼的交叉耐药性，该细胞株表现出含有ARE的基因表达增加，而并非通过绕过RTK信号通路激活EGFR的机制产生耐药，并且Brusatol协同治疗与导入野生型Keap1增强EGFR-TKIs敏感性的效果相同。在EGFR-TKIs耐药的NSCLC细胞系中，Nrf2蛋白水平显著增加，并且在HCC827ER和HCC827GR细胞中敲除Nrf2基因可以克服其对EGFR-TKIs的耐药性，这种耐药性的获得与Nrf2上调Gpx4和SOD2有关，进而靶向Nrf2-Gpx4/SOD2通路是克服EGFR-TKIs耐药的一种潜在策略[29]。

3 结语及展望

Keap1/Nrf2通路可以通过代谢重编程、抑制癌细胞凋亡、增强肿瘤干细胞自我更新能力等方式，诱导促生存基因表达及促进癌细胞增殖，与耐药密切相关，其异常表达常提示治疗抵抗及不良预后。Keap1/Nrf2在NSCLC中的研究具有非常重要的意义，其在NSLCL中突变频率高，可以作为一种新的基因监测方向；尤其Keap1与KRAS、TP53等基因存在共突变时，其对于肿瘤免疫微环境的影响对应用ICIs可能具有指导意义；针对Keap1/Nrf2通路是改善治疗抵抗的一个方向。Nrf2操纵着多种下游基因的表达，处于复杂调控网络的中心，故而其在NSCLC治疗抵抗中的作用机制具有多样性，各机制之间的交叉有待于进一步探索。也因为这种复杂性，目前尚无针对于此通路的药物应用于临床，具备广阔的研究前景。