LncRNA ROR 和TGF-β1 在乳腺癌患者中的表达及临床意义

张玉娟 叶惠荣 袁惠玲 王永霞

广东省东莞市人民医院乳腺科，广东东莞 523000

不同分子标记的乳腺癌亚型对治疗的反应和预后均存在较大差异，如何早期诊断和预测预后是乳腺癌研究的热点问题[1-2]。长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是长度大于200 个核苷酸的RNA 分子，具有结合靶基因启动子区调控基因转录、介导染色质重构及结合mRNA 抑制翻译过程等生物学作用[3-5]。LncRNA 参与包括癌变在内的多种疾病状态，在肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等恶性肿瘤中异常表达，与恶性肿瘤发生发展密切相关[6-8]。长链非编码RNA ROR（long noncoding RNA ROR，LncRNA ROR）是新近发现的LncRNA 分子，具有调节多能干细胞自我更新和分化的功能，子宫内膜癌、肝癌等多种肿瘤中发现LncRNA ROR 表达异常[9]。基础研究显示，LncRNA ROR/转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）途径激活促进裸鼠乳腺癌细胞增殖和侵袭[10]。研究显示，膀胱癌等肿瘤LncRNA ROR和TGF-β1 水平与血清表达均呈明显正相关，血清LncRNA ROR 和TGF-β1 的价值逐渐引起临床医师重视，但血清LncRNA ROR 和TGF-β1 水平与乳腺癌病理特征及预后因素的相关性鲜见报道[11]。本研究通过分析乳腺癌和健康女性血清LncRNA ROR与TGF-β1水平，分析两种标志物与乳腺癌病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018 年1 月至2019 年6 月在广东省东莞市人民医院（以下简称“我院”）经病理学确诊的73 例乳腺癌患者作为研究组（A 组），其中中高分化47 例，低分化26 例；Ⅰ期24 例，Ⅱ期23 例，Ⅲ期26 例；淋巴结转移37 例，无淋巴结转移36 例；表型：人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）阳性14 例，三阴性18 例，Luminal 41 例。纳入标准：①经病理或组织学检查确诊为乳腺癌；②年龄≥20 岁，初次确诊为乳腺癌，血清LncRNA ROR 和TGF-β1 检查前未接受放疗、化疗、免疫治疗等抗肿瘤治疗；③患者对本研究知情并签署知情同意书。排除标准：①合并严重心肝肾等功能不全；②合并其他部位原发性恶性肿瘤；③合并自身免疫性或急慢性传染病；④妊娠或哺乳期妇女；⑤精神疾病或严重认知功能障碍。随机抽取同期在我院就诊的经病理证实的37 例乳腺良性病变（包括乳腺腺病21 例，乳腺纤维腺瘤8 例，乳腺导管内乳头状瘤8 例）为对照1 组（B 组），随机抽取同期健康体检的37 名健康受试者作为对照2 组（C 组）。A、B、C 组受试者一般资料比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。见表1。

表1 三组一般资料比较

1.2 研究方法

受试者入组后抽取空腹静脉血，采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（real time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）法检测血清LncRNA ROR 水平，首先采用Triol 法（试剂盒购自Biosharp 公司，货号：20180911）提取血浆中总RNA，鉴别浓度和纯度后，以1 μg RNA为模板反转录为互补DNA（complementary deoxyribonu cleic acid，cDNA），严格按照TaKaRa 反转录试剂盒（购自红荣微再上海生物工程技术有限公司，货号：20180821）说明实施。qRT-PCR 反应体系为cDNA 0.2 μl，2×SYBR 5 μl，ROXⅡ0.2 μl，正反向引物各0.5 μl，RNA-free 水3.6 μl，总反应体系体积10 μl。反应条件为95℃预变性5 min、95℃变性30 s、62℃退火30 s、70℃延伸30 s，共40 个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，采用2-ΔΔCt法对检测结果进行定量分析。ROR 的正向引物序列：5’-CTCCAGCTATGCAGACCACTC-3’，反向引物：5’-GTGACGCCTGACCTGTTGAC-3’；GAPDH 的正向引物序列：5’-AATGGACAACTGGTCGTGGAC-3’，反向引物：5’-CCCTCCAGGGGATCTGTTTG-3’。采用酶联免疫吸附试验检测血清TGF-β1 水平，采用电化学发光法测定受试者肿瘤标志物水平，肿瘤标志物包括糖类抗原153（carbohy drate antigen 153，CA153）和癌胚抗原（carcinoembry onic antigen，CEA），试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，货号：20181016（TGF-β1）、20180721（CA153）和20181204（CEA），严格按照说明书操作，正常参考值范围：CEA≤5 ng/L，CA153 ≤25 U/ml。

1.3 观察指标

观察三组受试者血清LncRNA ROR 和TGF-β1水平和LncRNA ROR与TGF-β1 诊断乳腺癌的临床价值；观察A 组年龄（≤50 岁、＞50 岁）、病理学分级（中、高分化，低分化）、临床分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）、淋巴结转移（是、否）、表型（HER-2、三阴性、Luminal）等不同预后因素患者LncRNA ROR 和TGF-β1 水平的差别。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 法，计数资料采用例数或百分率表示，比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman 相关分析，采用受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC 曲线）计算LncRNA-ROR 和TGF-β1 预测乳腺癌的价值，曲线下面积（area under the curve，AUC）比较采用Z 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组受试者LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比较

A 组LncRNA ROR 和TGF-β1 水平高于B 组和C 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；B 组和C 组LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见表2。

表2 三组受试者LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比较（）

表2 三组受试者LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比较（）

注与B 组比较，aP ＜0.05；与C 组比较，bP ＜0.05。LncRNA ROR：长链非编码RNA ROR；TGF-β1：转化生长因子-β1

2.2 LncRNA ROR与TGF-β1 的相关性

Spearman 相关性分析显示，LncRNA ROR与TGFβ1 呈正相关（r=0.897，P ＜0.05）。

2.3 三组受试者肿瘤标志物水平比较

A 组CA153、CEA 水平高于B 组和C 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；B 组CA153 和CEA 水平高于C 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表3。

表3 受试者肿瘤标志物水平比较（）

表3 受试者肿瘤标志物水平比较（）

注与B 组比较，aP ＜0.05；与C 组比较，bP ＜0.05。CA153：糖类抗原153；CEA：癌胚抗原

2.4 不同指标预测乳腺癌的临床价值比较

LncRNA ROR 和TGF-β1 预测乳腺癌的AUC 比较，差异无统计学意义（Z=0.536，P=0.592），LncRNA ROR 预测乳腺癌的AUC 高于CA153 和CEA，差异有统计学意义（Z=3.158、3.152，P=0.002、0.000）；TGF-β1预测乳腺癌的AUC 高于CA153 和CEA，差异有统计学意义（Z=2.372、2.594，P=0.018、0.010）。见表4、图1A。以表4 中截断值作为判定阳性依据，LncRNA ROR：阳性＞1.45，阴性：≤1.45；TGF-β1 阳性：＞17.84 μg/ml，阴性：≤17.84 μg/ml。LncRNAROR 和TGF-β1 均阳性预测乳腺癌的特异性为98.65%，高于二者单一预测的特异性值；LncRNA ROR 阳性或TGF-β1 阳性预测乳腺癌的灵敏度为100%，高于二者单一预测的灵敏度值。见表4、图1B。

图1 不同指标预测乳腺癌的ROC 曲线

表4 不同指标预测乳腺癌的临床价值比较

2.5 乳腺癌患者不同临床特征LncRNA ROR 和TGFβ1 表达水平比较

不同年龄、分化程度、表型乳腺癌患者血清LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；不同临床肿瘤分期乳腺癌患者LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）；淋巴结转移乳腺癌患者血清LncRNA ROR 和TGF-β1水平均高于无淋巴结转移患者，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表5。

表5 乳腺癌患者不同临床特征LncRNA ROR和TGF-β1 表达水平比较（）

表5 乳腺癌患者不同临床特征LncRNA ROR和TGF-β1 表达水平比较（）

注 LncRNA ROR：长链非编码RNA ROR；TGF-β1：转化生长因子-β1；HER-2：人表皮生长因子受体-2

3 讨论

多项研究[12-14]显示，LncRNA 通过与转录因子、染色质修饰因子或核不均一核糖核蛋白结合调节基因表达，部分LncRNA 介导的功能破坏失调在肿瘤发生发展中发挥关键作用，LncRNA 在肿瘤患者诊断和预后评估方面具有潜在应用价值。LncRNA ROR 长2591 nts，又称为LincRNA-ST8SIA3，位于18q21.31，是p53 对DNA 损伤反应的强负性调节因子，其过度表达可导致miRNA与相应基因之间的负调控，与上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、肿瘤生长、转移、侵袭和化疗耐药相关[15]。

近年来的研究[16-21]显示，LncRNA ROR与胃癌、胆囊癌、非小细胞肺癌、肝细胞癌、胰腺导管腺癌等多种癌症发生相关，上述肿瘤组织和LncRNA ROR 表达高于正常组织，LncRNA ROR 表达升高的程度与肿瘤细胞侵袭、迁移和增殖呈正相关，但其影响肿瘤细胞生长、增殖、侵袭等生物学行为的机制尚未完全阐明。对乳腺癌来说，细胞侵袭和转移是导致预后较差、病死率高的重要原因，而EMT 是这个过程的重要环节[22]。LncRNA ROR 是EMT 的重要阳性调节因子，体外研究显示，LncRNA ROR 上调促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭，体内研究则可促进免疫缺陷小鼠的肿瘤转移[23]。TGF-β1 是诱导EMT 的重要诱导因子，可通过特异性识别下游细胞信使因子Smad2/3，使其磷酸化并与Smad4 形成寡聚体，并在细胞核内与基因启动子结合，促使靶基因转录[24]。研究显示，TGF-β1 可通过诱导EMT 促进包括乳腺癌在内的多种肿瘤转移，在多种肿瘤组织中呈高表达[25]。Hou 等[26]研究显示，LncRNA ROR 过度表达可通过影响TGF-β1 信号通路活性促进乳腺癌细胞增殖、侵袭及裸鼠肿瘤生长。本研究结果显示，在乳腺癌患血清中表现为LncRNA ROR 和TGF-β1 异常高表达，与Hou 等[26]研究中LncRNA ROR 和TGF-β1 的研究结果一致。本研究结果显示LncRNA ROR 和TGF-β1 预测乳腺癌的AUC 高于CA153 和CEA，提示LncRNA ROR 和TGF-β1 可能是乳腺癌潜在的生物标志物，鉴于本研究病例数有限，LncRNA ROR 和TGF-β1 和传统肿瘤标志物CA153和CEA 预测乳腺癌的临床价值差异尚需要进一步纳入更多病例进行论证。二者联合检测的结果显示，LncRNA ROR 和TGF-β1 均阳性作为预测因子，可提高特异性，有助于减少假阳性率，LncRNA ROR 和TGF-β1 之一阳性作为预测因子，可提高灵敏度，有助于减少假阴性率，结果提示，LncRNA ROR 和TGF-β1可能是乳腺癌潜在的生物标志物，二者不同联合方式有助于乳腺癌的确诊和排除。

临床研究[27]显示，TGF-β1与乳腺癌患者肿瘤分期相关，临床分期Ⅲ期和淋巴结转移的乳腺癌组织中TGF-β1 水平显著升高。本研究结果同样显示，不同临床肿瘤分期增加和是否淋巴结转移的乳腺癌患者之间LncRNA ROR 和TGF-β1 比较，差异有统计学意义（P ＜0.05），这与既往研究[27]中TGF-β1 促进乳腺癌发展及淋巴结转移的研究一致。本研究结果显示，患者血清LncRNA ROR 和TGF-β1 表达与患者年龄、肿瘤分化程度等无关，与既往研究一致。HER2 是一种185 kD 的糖蛋白，20%～30%初诊浸润性乳腺癌显示HER2 阳性[28-29]。Merry 等[30]曾用HER2阳性乳腺癌细胞体外培养研究LncRNA与HER2 阳性乳腺癌之间的关系，该研究发现仅三种LncRNA（linc-STARD6-2、linc-GJA1-2 和linc-SLC39A10-10）表达与HER2 表达相关，不包括LncRNA ROR。Luo 等[31]曾对乳腺癌不同表现LncRNA 功能多态性进行研究，结果显示，LncRNA 功能多态性与雌激素受体、HER-2表达不存在相关性。本研究未观察到LncRNA ROR 和TGF-β1与乳腺癌表现型的相关性，与既往研究一致。

综上所述，本研究结果显示，血清LncRNA ROR和TGF-β1 可能是乳腺癌潜在的生物标志物，患者血清LncRNA ROR 和TGF-β1 表达与临床肿瘤分期和淋巴结转移相关，对预后判定具有一定参考价值。