口腔癌临床病理标本中PD-L1 表达水平

孟庆伟

北京怀柔医院口腔科，北京 101400

口腔癌，是头颈部较为常见的恶性肿瘤之一[1-4]。目前，全球有众多研究团队正进行着程序性死亡蛋白配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）类药物治疗各种类型恶性肿瘤的研究[5]，然而将PD-1类药物应用于口腔癌方面的研究却鲜有报道。因此，为了探索PD-1类药物在口腔癌方面的应用前景，探究口腔癌发生发展的可能机制，本研究对已确诊的各类型口腔癌患者的肿瘤组织切片，采用免疫组织化学法对PD-1 蛋白进行了染色，初步结果如下：

1 对象与方法

1.1 研究对象

2015 年1 月至2020 年1 月，收集经北京怀柔医院口腔科手术切除并确诊为口腔癌的病理组织20 例，其中口咽癌8 例、上颌窦癌6 例、舌癌6 例，经病理诊断均为鳞状上皮细胞癌。纳入标准：①经病理学确诊为口腔癌；②首次确诊；③病理组织为原位肿瘤切片。排除标准：①曾接受过任何免疫治疗；②曾接受任何靶向治疗；③曾接受任何放、化疗；④病理组织切片为穿刺组织。所有病理组织经福尔马林固定后，进行常规石蜡包埋，5 μm 连续切片。该研究已获得医院医学伦理委员会批准及备案。

1.2 试剂与耗材

PD-L1 兔单克隆抗体（美国spring，M4422）；免疫组织化学用超敏型羊抗鼠/兔二抗试剂盒（美国UltraSensitive，KIT-0305）；DAB 试剂盒（中杉金桥，ZLI-9017）；脱蜡液（中杉金桥，ZLI-9315）；内源性过氧化物酶阻断剂（中杉金桥，PV-9000）；3%BSA（碧云天，P0007）；苏木素染色液（中杉金桥，BSBA-4041）；中性树胶（中杉金桥，ZLI-9555）；免疫组化抗原修复缓冲液（中杉金桥，ZLI-9065）；PBS 磷酸盐缓冲液；梯度酒精（浓度分别为50%、70%、80%、95%、100%）等。

1.3 实验仪器

切片机（德国LEICA，RM2235）；烤片机（德国LEICA，H1220）；显微镜（日本OLYMPUS，CX31）；离心机（美国Thermo，ST-8）；切片架；烧杯；量筒等。

1.4 实验方法

①切片脱蜡；②梯度酒精复水；③抗原修复；④一抗孵育：PD-L1/CD274（SP142）兔单克隆抗体1∶200 稀释后取50 μl 滴入切片反应区域，4℃孵育过夜后，PBS 洗涤3 次，3 min/次；⑤二抗孵育：超敏型羊抗鼠/兔二抗1∶100 稀释后取100 μl 滴入切片反应区域，用移液器吸头涂抹均匀，置于烘箱中37℃反应1 h，PBS洗涤3 次，3 min/次；⑥DAB 显色；⑦复染；⑧脱水；⑨透明；⑩封片。

1.5 评价标准

所有切片于光学显微镜（10 目镜×40 物镜）下随机选取10 个组织区域进行摄片，并分别计算阳性细胞比例（阳性细胞数量÷区域内所有细胞数量×100%）后取平均值，依照业内通用的免疫组化阳性等级评价标准[6]进行分级：阳性细胞比例≥50%为强阳性，25%～＜50%为中等阳性，5%～＜25%为弱阳性，＜5%为阴性。

2 结果

2.1 口咽癌病理组织中PD-L1 的表达及分布情况

8 例口咽癌病理组织中，共计4 例（50%）PD-L1呈强阳性表达，1 例（12.5%）PD-L1 呈中等阳性表达，1 例（12.5%）PD-L1 呈弱阳性表达，2 例（25%）呈阴性表达，合计阳性表达率为75%。见图1、表1。

表1 各口咽癌石蜡切片PD-L1 阳性表达情况

图1 口咽癌石蜡切片PD-L1 免疫组化染色结果

2.2 上颌窦癌病理组织中PD-L1 的表达及分布情况

6 例上颌窦癌病理组织中，共计2 例（33.3%）PD-L1 呈强阳性表达，1 例（16.7%）PD-L1 呈中等阳性表达，1 例（16.7%）PD-L1 呈弱阳性表达，2 例（33.3%）呈阴性表达，合计阳性表达率为66.7%。见图2、表2。

表2 各上颌窦癌石蜡切片PD-L1 阳性表达情况

图2 上颌窦癌石蜡切片PD-L1 免疫组化染色结果

2.3 舌癌病理组织中PD-L1 的表达及分布情况

6 例上颌窦癌病理组织中，0 例PD-L1 呈强阳性表达，2例（33.3%）PD-L1呈中等阳性表达，2例（33.3%）PD-L1 呈弱阳性表达，2 例（33.3%）呈阴性表达，合计阳性表达率为66.7%。见图3、表3。

表3 各舌癌石蜡切片PD-L1 阳性表达情况

图3 舌癌石蜡切片PD-L1 免疫组化染色结果

3 讨论

PD-1 是由基因PDCD1 编码，由288 个氨基酸组成的跨膜蛋白[7-16]。现如今，口咽癌、上颌窦癌、舌癌等口腔癌的发病机制不甚明确[5，17-20]，亦无具有显著疗效的药物或疗法[21]，现阶段多采用常规手术、化疗、放疗等治疗手段，临床效果也不甚明显[21-23]。因此，探寻口腔癌的发病机制及特效药物是当下迫在眉睫的工作。在本研究所收集的20 例口腔癌病理组织中，PD-L1强阳性表达共计6 例（30%），PD-L1 中等阳性表达共计4 例（20%），PD-L1 弱阳性表达共计4 例（20%），PD-L1 阴性表达共计6 例（30%），PD-L1 阳性表达共计14 例（70%）。因此，咽癌、上颌窦癌、舌癌等口腔癌的发病机制亦有可能是肿瘤细胞高表达PD-L1 引起免疫逃逸造成的，PD-1 免疫点抑制剂类药物应用于口腔癌可能具有一定的治疗效果。但限于本研究仅纳入病例较少，该推论是否正确还有待进一步考证。据此，本课题组下一步拟扩大对口腔癌病理组织PD-L1表达的检测范围，为PD-1类药物在口腔癌方面的应用提供准确的实验数据与理论支持。