染色体微阵列分析技术在偶发自然流产遗传学诊断中的应用*

夏政怡，周 冉，孟露露，李一鸣，林迎春，胡 平，许争峰，朱巧英,王 艳

[南京医科大学附属妇产医院(南京市妇幼保健院)产前诊断中心，南京 210004]

自然流产是妊娠早期常见的并发症，人群中发生率约为15.3%，育龄期妇女两次自然流产的发生率约为1.9%，3次及以上发生率约为0.7%[1]。自然流产病因复杂，包括遗传、解剖、内分泌、免疫及环境等因素，其中胚胎染色体异常占50%以上[2]。对自然流产胚胎进行遗传学检测不仅有助于明确本次流产的原因，减轻患者的心理负担，还可为夫妇下次妊娠提供精准的遗传学建议，如胚胎植入前遗传学诊断或产前遗传学诊断。染色体核型分析技术作为传统的遗传学诊断技术，可检测异倍体、多倍体及大片段缺失或重复等异常，但存在分辨率低、母体细胞污染、培养失败及耗时长等问题[3]。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)可直接分析间期染色体，无需细胞培养，但只能对特定几条染色体行异倍体检查，检测能力有限[3]。染色体微阵列分析(chromosomal microarray analysis,CMA)作为一种高分辨率的分子遗传学检测手段，除了能检测到传统核型分析技术能检测到的数目异常和大片段结构异常外，还能鉴别出10Mb以下的拷贝数变异(copy number variants,CNVs)。一项比较CMA和核型分析在早期流产病例中应用价值的荟萃分析显示，相较于核型技术，CMA的检测成功率提高了28%，并能额外检测出2%的致病性CNVs[4]。近年来，有关流产物遗传学检测的研究主要集中于复发性自然流产(recurrent miscarriage,RM)[5]，采用CMA对自然流产(spontaneous abortion,SA)进行遗传学分析的研究较少[6]。本研究采用CMA技术对1854例SA和1216例RM病例的胚胎样本行CMA检测，评估CMA在SA遗传学诊断中的价值，并为再次生育提供遗传学风险评估及指导意见。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年8月至2021年3月在南京医科大学附属妇产医院就诊的1854例SA及1216例RM病例行CMA检测。本研究中SA定义为首次发生的自然流产，RM定义为2次及以上的自然流产。SA组母亲的平均年龄30.2岁(18～40岁)，平均孕周10.1周(6～27周)。RM组母亲的平均年龄30.9岁(21～42岁)，平均孕周9.7周(6～28周)。患者行CMA检测前均已签署知情同意书。

1.2 标本收集 所有送检样本均经生理盐水冲洗3次，在解剖显微镜下按标准技术分离绒毛和母体蜕膜组织。无法与母体蜕膜组织分离的绒毛样本被排除在外。采用QIAamp DNA MiniKit试剂盒(Qiagen,德国)从流产物绒毛组织中提取全基因组DNA。本研究获得南京市妇幼保健院医学伦理委员会批准。

1.3 CMA检测方法及结果判读 采用CytoScan 750K芯片(Affymetrix,美国)及HumanCytoSNP-12芯片(Illumina,美国)对绒毛DNA样本进行检测，按标准流程进行实验操作[7]。CytoScan 750K芯片由55万个核苷酸探针及20万个SNP探针组成，HumanCytoSNP-12芯片由30万个SNP探针组成。CMA检测提示母体细胞污染超过30%的绒毛样本被排除在外。根据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)和临床基因组资源机构(ClinGen)制定的CNV致病性判读指南进行CNVs致病性判断[8]，并将CNVs结果分为如下5类：(1)致病性CNVs；(2)可疑致病CNVs；(3)临床意义不明确的CNVs(variant of uncertain significance,VOUS)；(4)可能良性CNVs；(5)良性CNVs。本研究仅报告致病性、可疑致病及VOUS。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件，计数资料以频数及率(%)表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

排除74例重度母体细胞污染样本，共2996例绒毛样本(1815例SA和1181例RM样本)纳入最终研究。SA样本中，总体致病性染色体异常率为61.0%(1108/1815)，其中异倍体为48.3%(876/1815)，多倍体为8.2%(148/1815)，染色体大片段结构异常(>10Mb)为3.3%(60/1815)，致病性微缺失/微重复(<10Mb)为0.9%(17/1815)，单亲二倍体(uniparental disomy,UPD)为0.4%(7/1815)；RM样本中，总体致病性染色体异常率为59.4%(702/1181)，其中异倍体为43.6%(515/1181)，多倍体为8.2%(97/1181)，染色体大片段结构异常(>10Mb)为5.0%(59/1181)，致病性微缺失/微重复(<10Mb)为1.7%(20/1181)，UPD为0.9%(11/1181)。两组总体致病性染色体异常率无统计学差异(61.0% vs 59.4%，P=0.380)(表1)。

表1 1815例SA和1181例RM病例的致病性染色体异常分布

2.1 SA组染色体数目异常及UPD SA组共检出染色体数目异常1024例(56.4%，1024/1815)，包括单个异倍体838例(46.2%，838/1815)，多个异倍体38例(2.1%，38/1815)，多倍体148例(8.2%，148/1815)。838例单个异倍体中，除1号染色体外，其余染色体均检出异倍体，其中以16号三体(224例)最常见，其次是X/Y、22和21号染色体，19和17号异倍体相对少见(图1)。38例多个异倍体中，双重三体32例，三重三体2例(1例49,XY,+12,+16+21和1例49,XX,+10,+14+16)，单体合并三体4例(1例46,X0,+5、1例46,X0,+16和2例46,X0,+21)。148例多倍体中，三倍体134例(7.4%，134/1815)，亚三倍体4例(0.2%，4/1815)，超三倍体7例(0.4%，7/1815)，四倍体3例(0.2%，3/1815例)。本研究还检出7例全基因组UPD。

图1 SA组单个异倍体异常染色体分布情况

2.2 SA组大片段结构异常(>10Mb) 共检出60例(3.3%，60/1815)致病性大片段结构异常，包括“末端缺失/重复”13例(0.7%，13/1815)，“中间缺失/重复”3例(0.2%，3/1815)，“末端缺失+末端重复”(提示染色体非平衡易位可能)20例(1.1%，20/1815)，“多个缺失和(或)重复”24例(1.3%，24/1815)。60例SA样本有39例通过核型检测或FISH行双亲溯源检查，其中30对夫妇染色体未见明显异常，提示胚胎染色体异常为新发变异，另有3例检测结果提示为母系遗传，6例为父系遗传(表2)。

表2 SA病例中9例遗传性大片段结构异常

2.3 SA组致病性微缺失/微重复(<10Mb) 共检出17例(0.9%，17/1815)致病性微缺失/微重复，其中“末端微缺失/微重复”4例(0.2%，4/1815)，“中间微缺失/微重复”10例(0.6%，10/1815)，“多个微缺失和/微重复”3例(0.2%，3/1815)。CNVs大小从0.17Mb到7.07Mb不等。17例样本中16例行双亲溯源检查，其中13例提示新发变异，3例(病例1、4和6)为母系遗传(表3)。

表3 SA组17例致病性微缺失/微重复CMA结果

2.4 SA组母亲年龄及孕周比较 母亲年龄≥35岁组的染色体异常检出率明显高于<35岁组(72.5% vs 58.9%，P<0.01)。流产时孕周<13周组的染色体异常检出率明显高于≥13周组(62.3% vs 46.9%，P<0.01)。异倍体在以上两种分组间均存在显著差异(P<0.01)，多倍体、大片段结构异常、致病性微缺失/微重复、UPD在两组间差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 SA病例中不同年龄段及不同孕周CMA结果比较

3 讨 论

本研究显示，SA和RM病例中总体致病性染色体异常率无统计学差异，提示胚胎染色体检查对SA同样具有重要临床意义。目前认为,异倍体的发生是由于减数分裂或有丝分裂时染色体的错误分离所致[9]。本研究中SA组单个异倍体异常检出率显著高于RM组(46.2% vs 41.2%，P=0.008)，提示相比RM，染色体的错误分离事件在SA病例中更常见。此外，SA组染色体大片段结构异常检出率低于RM组(3.3% vs 5.0%，P=0.021),考虑大片段结构异常所致的胚胎发育异常或自然流产在RM组中可能更多见，但具体原因尚未明确。胚胎染色体结果为末端缺失+末端重复，提示双亲一方可能是染色体平衡易位或倒位携带者。本研究中SA组和RM组中“末端缺失+末端重复”的发生率差异无统计学意义(1.1% vs 1.5%，P=0.313)，更加肯定了SA患者行流产物染色体检查的必要性。通过对SA流产物行染色体检测不仅能识别出潜在的染色体异常，减轻患者心理负担，还能明确双亲可能存在的染色体异常,如平衡易位，指导患者采取合适的受孕方式,如辅助生殖或自然受孕，避免RM的发生。

染色体数目异常是SA最常见的原因，并以异倍体最多见。本研究中除1号染色体外，其余染色体均检出异倍体，并以常染色体三体尤其是16号三体最多见，这与Gou等[10]报道一致。多倍体中以三倍体最常见(90.5%，134/148)，相比之下亚三倍体(2.7%，4/148)、超三倍体(4.7%，7/148)和四倍体(2.0%，3/148)相对少见。此外，SA组还检出7例全基因组UPD(0.4%)，略高于Levy等[11]研究中的0.3%。目前普遍认为，UPD的发生与配子互补、单体营救及三体自救等有关[12-13]。父源全基因组UPD提示葡萄胎可能性大，然而这种染色体异常在早期超声检查时难以发现，易被误诊为流产。

染色体大片段结构异常是导致自然流产的重要原因之一。本研究SA病例中大片段结构异常检出率为3.3%(60/1815)，高于Sahoo等[14]研究中的1.7%。胚胎“末端缺失+末端重复”型染色体异常通常提示胚胎存在非平衡易位，考虑双亲之一是平衡易位携带者可能性较大。本研究中“末端缺失+末端重复”型检出率为1.1%(20/1815)，其中14例行双亲溯源检查，发现8例病例双亲之一为平衡易位携带者，为患者再次妊娠提供了准确的风险评估及妊娠方式的选择，避免了RM及出生缺陷儿的出生。综上所述，胚胎遗传学分析可提示双亲可能存在的染色体异常，尽早发现可能导致SA的遗传学因素，以通过胚胎植入前遗传学诊断或产前遗传学诊断的介入避免RM的发生。

致病性微缺失/微重复是胎儿结构畸形和神经发育障碍患者的重要病因[15-16]，然而此类异常与自然流产的相关性尚未明确。既往研究表明，自然流产病例中致病性微缺失/微重复的发生率为0.6%～0.8%[11,14]。本研究中SA病例中致病性微缺失/微重复的发生率为0.9%(17/1815)。本研究17例致病性微缺失/微重复中，3例是遗传性的。Xp22.31区段(含4个OMIM基因PUDP,STS,VCX,PNPLA4)缺失可导致X连锁的鱼鳞病(X-linked ichthyosis,XLI)(OMIM # 308100)，关键致病基因为STS，该病遗传模式为X连锁隐性遗传，发病率约为1/4000(病例4和6)。XLI女性携带者的男性后代有50%发病，主要表现为以腹部和四肢伸侧为主的皮肤干燥粗糙，呈黑褐色鳞片状，无毛囊角化，少部分患者可出现角膜混浊和支气管哮喘等皮肤外反应及癫痫、智力低下等精神神经系统症状，而女性后代由于X染色体的失活几乎无症状或仅表现为皮肤干燥[17-18]。本研究发现，2例Xp22.31区段缺失病例，均遗传自母亲，再次妊娠可选择胚胎植入前遗传学诊断或产前诊断。15q11.2区段(含4个OMIM基因TUBGCP5、CYFIP1、NIPA1和NIPA2)缺失可导致15q11.2 BP1-BP2微缺失综合征(OMIM # 615656)(病例1)。该综合征的发生率约0.57%～1.27%，外显率为10.4%，多伴有发育和语言延迟及神经行为障碍，少数患者可出现自闭症、癫痫和精神分裂症等精神症状[19]。据报道，15q11.2 BP1-BP2微缺失综合征的新发突变率为5%～22%，51%的个体遗传自表型正常的父母，35%遗传自表型异常的父母[19]。上述微缺失/微重复与自然流产的相关性还需进一步的大规模研究以及功能实验来证实。

本研究发现，SA病例中≥35岁母亲的胚胎染色体异常率明显高于<35岁者(72.5% vs 58.9%，P<0.01)，提示随着母亲年龄的增加，染色体异常率逐步上升。此外，<13孕周的胚胎染色体异常检出率明显高于≥13孕周者(62.3% vs 46.9%，P<0,01)，表明早期流产胚胎染色体异常的发生率明显高于晚期流产。这两种异常均与Gou等研究结果一致[10]。这两种显著差异均由胚胎异倍体异常所致，目前考虑异倍体的发生与减数分裂或有丝分裂时染色体错误分离有关，并且随着母亲年龄的增加，卵母细胞质量和受精卵着床率的下降，这种差异性更为显著[9]。

综上所述，CMA具有检测成功率高、分辨率高、检测周期短等优势，在SA病因学研究中具有重要临床价值。对SA人群行CMA检测，除能明确本次流产的遗传学病因外，对某些特定的胚胎染色体异常，进一步行双亲遗传学检测能及时发现潜在的平衡易位携带者可能，避免RM的发生，为再生育提供精准的临床遗传咨询和科学理论依据。