NLRP6在未足月胎膜早破合并HCA孕妇血清及胎膜组织中的表达及临床意义*

李亚楠，朱锦明，栾晓梅，彭凤云，李 青，杜长江

(1.徐州医科大学研究生院，徐州 221006；2.徐州医科大学附属徐州妇幼保健院，徐州 221009)

胎膜早破(premature rupture of membranes,PROM)是指临产前胎膜自然破裂，是产科常见的妊娠期并发症，根据胎膜早破发生的时间是否达到妊娠37周可分为足月胎膜早破(time-premature rupture of membranes，TPROM)和未足月胎膜早破(preterm premature rupture of membranes，PPROM)[1]。阴道菌群上行感染、羊膜腔压力变化等是导致PROM发生的常见原因，其中60%以上的PROM与感染有关。感染和胎膜早破之间互为因果关系，且感染是PROM的最重要原因，下生殖道感染容易造成胎膜早破，胎膜早破又导致阴道上行性感染的几率增加。在一项研究中，对不明原因早产及合并单一妊娠期并发症/合并症的673例病例分析，发现PPROM最常见(45.6%，307/673)[2]。绒毛膜羊膜炎(chorioamnionitis，CA)是PROM的常见并发症，可分为临床绒毛膜羊膜炎与组织学绒毛膜羊膜炎(histological chorioamnionitis，HCA)两类，其引发了40%～70%的早产，尤其是低胎龄的发病率更高[3]。HCA无明显的临床症状和体征，其定义为病理检查绒毛膜及羊膜组织中每高倍镜视野超过5个中性粒细胞浸润诊断为HCA[4]，故引起越来越多临床医生的关注。NLRP6是胞内模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)的一种，其在多种细胞和组织中表达[5]，可被外源性或内源性危险信号激活，促动下游炎症细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)并以半胱氨酸蛋白酶-1(cysteineprotease，caspase-1)依赖的方式产生炎症级联反应，引起多种疾病的发生，如牙周炎、肺炎等。本研究将对PPROM患者合并HCA与正常对照组患者的血清及胎膜组织中NLRP6及caspase-1进行检测，进一步探讨导致胎膜早破合并HCA的原因。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2020年12月至2021年6月于徐州医科大学附属徐州妇幼保健院行剖宫产分娩的PPROM患者60例，根据胎膜病理结果分为未合并HCA的PPROM组33例、未合并HCA的PPROM组27例；选取同期行剖宫产分娩的50例未合并HCA的足月孕妇为对照组。胎膜早破组和对照组孕妇的年龄、既往生产史比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。纳入标准：临床确诊为胎膜早破且临床资料完整；妊娠28～36+6周；单胎妊娠；分娩后常规行胎膜病理检查；因合并疤痕子宫、羊水过少、胎位异常等行剖宫产术的孕妇。排除标准：排除全身感染的临床征象；临床绒毛膜羊膜炎；有心、肝、肾、内分泌疾病及自身免疫性疾病；妊娠合并症或并发症；分娩前未使用抗生素及激素类药物；排除羊水过多、巨大儿、多胎妊娠等可能导致胎膜早破的因素。对照组排除HCA。研究对象均征得患者书面同意并经徐州医科大学附属徐州妇幼保健院伦理委员会同意(批准号：徐州市妇幼保健院[2020]伦理第(15)号)。

表1 孕妇一般情况比较

1.2 诊断标准 (1)胎膜早破诊断标准：孕妇主诉阴道流液或外阴湿润。窥阴器检查见液体自宫颈口内流出或后穹窿有液池形成，超声检查发现羊水量较破膜前减少，pH试纸检测羊水偏碱性，阴道后穹窿积液涂片见到羊齿植物状结晶。(2)HCA诊断标准：病理检查绒毛膜及羊膜组织中每高倍镜视野超过5个中性粒细胞浸润且孕妇无临床表现；(3)临床绒毛膜羊膜炎诊断标准：①母体体温≥38℃；②阴道分泌物异味；③胎心率增快或母体心率增快；④母体外周血白细胞计数≥15×109/L；⑤子宫呈激惹状态、宫体有压痛。母体体温升高的同时伴有以上②～⑤项中的任何一项即可诊断临床绒毛膜羊膜炎。

1.3 ELISA法检测NLRP6、caspase-1表达水平 孕妇均于入院治疗前抽取肘静脉血4mL，静置30min，3000r/min离心20min，留取血清，避免溶血的标本，标记后-80℃冰箱保存。双抗体夹心法测定标本中NLRP6和caspase-1表达水平，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，由标准曲线得出各样品对应检测结果(试剂盒：江苏酶标生物科技有限公司)。

1.4 免疫组化法检测胎膜组织中NLRP6蛋白表达水平及定位 采用免疫组化SP二步法检测胎膜组织中NLRP6蛋白，一抗为兔抗人单克隆NLRP6抗体(英国Abcam公司)，严格按试剂盒说明书步骤操作。利用image pro plus软件对免疫组化结果进行定量分析，将图片各点的光密度值累计起来，得到累积光密度值(IOD)，IOD值除以有效目标分布区域的面积，得到平均光密度值(Mean Density)值后进行统计学分析。

1.5 Western blot法检测胎膜组织中NLRP6、caspase-1蛋白表达 无菌操作下取20mg胎膜组织，加200μL RIPA裂解液及2μL蛋白酶抑制剂(10∶100∶1)，-4℃条件下离心，取上清，BCA法进行蛋白定量分析，电泳、切胶、电转，快速封闭液室温封闭0.5h，加NLRP6单抗(1∶1000)(Bioworld Techology.Inc)、caspase-1单抗(1∶1000)(Bioworld Techology.Inc)孵育过夜，洗膜，加相应二抗(1∶1000)(Bioworld Techology.Inc)孵育，洗涤后曝光，以β-actin作为内参，进行灰度分析。

1.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定胎膜NLRP6、caspase-1 mRNA表达量 Trizol法处理组织样品，提取总RNA，逆转录为cDNA，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。NLRP6引物序列，上游5'-CCGAGAAGGAACTGGAGCAACTG-3'，下游5'-CTGGAAGCTCTGGTCGATGAACTG-3'。caspase-1引物序列，上游5'-CTCAGGCTCAGAAGGGAATGA-3'，下游5'-CGCTGTACCCCAGATTTTGT-3'，目的基因扩增40个循环。GAPDH序列，上游5'-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'，下游5'-GAAGCTGGGGCTCATTT-3'作为内参对照，计算相对含量。2-△△CT法计算各组表达水平的倍数差异。

2 结 果

2.1 C反应蛋白及白细胞计数 PPROM组孕妇血清中CRP及白细胞计数表达高于对照组，但3组之间比较差异并无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 三组孕妇外周血中CRP、白细胞计数表达

2.2 ELISA检测结果 PPROM孕妇血清中NLRP6、caspase-1表达高于对照组(P<0.05)，其中合并HCA的PPROM组与未合并HCA的PPROM组比较，差异有统计学意义(P<0.001)。见表3。

表3 孕妇外周血中NLRP6、Caspase-1表达量

2.3 PPROM孕妇血清中NLRP6、caspase-1水平相关性分析 PPROM孕妇血清中NLRP6、caspase-1水平呈正相关(r=0.8395，P<0.001)。见图1。

图1 血清中NLRP6和caspase-1水平相关性散点图

2.4 免疫组化结果 NLRP6蛋白主要表达于胎膜上皮细胞、间充质细胞的细胞质及绒毛膜滋养细胞中，部分表达于细胞核(图2)。3组孕妇胎膜中NLRP6蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)；PPROM组表达量均高于对照组，其中合并HCA的PPROM组和对照组、未合并HCA的PPROM组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图2 NLRP6在孕妇胎膜组织中的表达(DAB染色×200)

图3 NLRP6在孕妇胎膜组织中的表达

2.5 孕妇胎膜组织中NLRP6、caspase-1蛋白及mRNA表达水平 胎膜组织NLRP6、caspase-1蛋白和mRNA在合并HCA的PPROM组中表达水平最高，且合并HCA的PPROM组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图4 孕妇胎膜组织中NLRP6及caspase-1表达

3 讨 论

PROM指临产前胎膜自然破裂，其常见的并发症为CA，两者互为因果，可分为临床绒毛膜羊膜炎与HCA两类，CA可能导致严重的产妇并发症，如败血症、伤口感染等[6]。随着围产期保健水平的提升，临床绒毛膜羊膜炎的发病率明显降低，而PPROM合并HCA并无明显的临床症状，早期诊断并不明确，目前发病率也有所增加。因此，早期识别PPROM合并HCA在临床上十分重要。

天然免疫也称固有免疫，其是机体免疫系统直接抵御病原体入侵的最初阶段，可通过机体自身的特异性模式识别受体(PRRs)来识别病原体特有的保守结构病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)[7]。NLRP6属于胞浆内NOD样受体家族，其编码基因位于人11号染色体(11P15.5)[8]，与NLRP3相似，其富含亮氨酸的重复序列，被认为是天然免疫的重要效应因子。作为胞内的模式识别受体，有研究显示NLRP6可从革兰氏阳性病原体中识别病毒RNA和脂磷壁酸[9]，也可识别LPS，并在ATP刺激下自组装成线性分子平台[10]。多项研究显示，造成胎膜早破的原因主要来自于下生殖道的上行性感染，如B族溶血性链球菌、支原体、弓形虫等[11]。由此推测NLRP6在外源性因素的刺激下表达于胎膜上参与绒毛膜羊膜炎的发生。

NLRP6已被提出具有多种功能，包括控制微生物群、维持上皮完整性、调节代谢性疾病、调节微生物感染期间的宿主防御、癌症保护和神经炎症调节等作用[12]。近年来，研究指出在炎症疾病方面，NLRP6既有促炎作用也有抗炎作用。Xiao等[13]研究发现，炎症是导致脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后继发性脑损伤的关键因素，在ICH大鼠模型中，NLRP6敲低可减少脑损伤、减轻炎症，并且指出NLRP6介导ICH后的炎症是炎性小体依赖性的。而在先天性巨结肠相关性小肠结肠炎(hirschsprung associated enterocolotis，HAEC)患者中NLRP6表达降低可能导致先天性巨结肠(hirschsprung，HSCR)患者的结肠微生物群发生改变，并增加了发生HAEC的易感性[14]。这些研究表明在机体不同的组织中NLRP6发挥的作用可能不同。

本研究结果显示，PPROM孕妇血清中NLRP6水平与胎膜中NLRP6蛋白表达水平同步升高，可能是局部感染的因素刺激绒毛膜滋养细胞产生NLRP6释放入血，引起血清中NLRP6水平升高。Shen等[15]通过对NLRP6 pyrin结构域(PYD)的低温电子显微镜和晶体结构研究发现，NLRP6 PYD能组装成丝状结构，通过同型PYD-PYD的相互作用招募ASC，ASC通过CARD-CARD相互作用招募caspase-1，导致caspase-1的激活。Liu等[16]研究发现，在牙龈卟啉单胞菌刺激下，牙龈成纤维细胞中NLRP6过表达激活caspase-1，导致促炎介质IL-1β和IL-18的释放，引起牙周炎的发生。此外，与健康对照组相比，NLRP6在牙周炎牙龈组织中高表达。同样，在一项NLRP6炎性小体在肺炎链球菌感染巨噬细胞过程中对促炎细胞因子产生的研究中[17]，采用ELISA法检测上清液中炎性细胞因子的分泌情况。结果显示，肺炎链球菌诱导WT小鼠巨噬细胞分泌大量IL-1β，而NLRP6-/-巨噬细胞分泌这些细胞因子显著减少。表明IL-1β产生部分依赖于肺炎链球菌感染巨噬细胞NLRP6的激活，在这一过程中，caspase-1可被招募并裂解前IL-1β为IL-1β。而IL-1β和IL-18的产生与胎膜早破合并HCA的发生发展有关[18]。由此推测NLRP6可能是以caspase-1依赖的方式产生炎症级联反应，使胎膜组织水肿、变脆而发生破裂导致PPROM。Anandl等[19]研究以NLRP6为靶点增强对细菌感染的免疫力，提出中和NLRP6可能提高宿主对细胞内外的细菌病原体和革兰氏阳性细菌的防御能力，增强固有免疫防御，其药理作用可能成为一种对抗细菌性疾病的有效疗法。根据本实验结果推测其可作为一种血清因子，可用来预测HCA的发生，且其创伤性较小。

本研究结果显示，NLRP6主要表达于胎膜上皮细胞、间充质细胞的细胞质、绒毛膜滋养细胞中。Zhu等[20]研究发现，与NLRP6同为NOD受体家族的NLRP3表达于胎膜上皮细胞、间充质细胞的细胞质中，与本研究结果相符，合并HCA的PPROM组患者胎膜组织中NLRP6及caspase-1蛋白和mRNA表达显著高于对照组及未合并HCA的PPROM组。可能原因是胎膜组织中NLRP6以caspase-1依赖的方式，在病原体入侵后，诱导炎症反应，启动机体的非特异性免疫应答，导致下游炎症介质的表达升高，产生大量酶类，特别是胶质酶和含金属蛋白酶类，破坏胎膜的胶质[21]，导致羊膜的张力强度和弹性下降，发生胎膜早破。本研究结果还显示，合并HCA的PPROM患者血清中NLRP6以及caspase-1表达较对照组显著增加，而未合并HCA的PPROM组患者母血中NLRP6以及caspase-1表达较对照组无显著差异，且3组之间白细胞计数、CRP比较差异无统计学意义。可能是NLRP6的释放引起了机体的局部炎症反应，呈亚临床感染状态，并未引起全身的免疫反应，导致血中CRP及白细胞计数水平升高，推测NLRP6可能作为一种体液调节因子，其在外源性因素的刺激作用下形成有功能的炎性小体。在一项对NLRP6在大鼠脑缺血再灌注(I/R)损伤的研究中，使用大脑中动脉闭塞/再灌注模型(MCAO)模拟缺血性损伤，结果显示下调NLRP6后脑组织的病理损伤得到改善，表明NLRP6在脑I/R损伤中具有促炎症作用[22]，与本研究结果相符。这对于临床早期发现合并HCA的PPROM患者具有积极的临床意义，从而减少感染的发生以及改善新生儿预后。

综上所述，NLRP6可能以caspase-1依赖的方式参与PPROM合并HCA的发生。本研究仅从体内实验进行了研究，且病例数较少，具有一定的局限性，NLRP6在感染上的具体作用机制有待进一步探讨，未来可从细胞水平探究相关机制，提供一个预测HCA的因子。