阿尔茨海默病及轻度认知功能障碍患者单核细胞的Aβ42吞噬功能研究

梁庆华 利荣乔 何本进（广西壮族自治区江滨医院，南宁 530021）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是引起进行性痴呆的主要病因，在人脑皮层和边缘区中存在β 淀粉样蛋白（amyloid-beta，Aβ）斑块的细胞外聚集和细胞内神经纤维缠结形成，由过度磷酸化的tau 蛋白组成，其中β-淀粉样多肽1-42（β-amyloid 42，Aβ42）是AD 脑内Aβ 沉积最具特征性的表现，Aβ42 沉积可形成老年斑，造成神经元变性和死亡［1-2］，而有效清除脑内Aβ沉积是目前治疗AD 亟待解决的关键问题。在AD 患者脑内Aβ 沉积的血管周围部位和老年斑中心存在吞噬Aβ 血液或骨髓来源的吞噬细胞浸润，通过招募更多的包括单核细胞和小胶质细胞在内的单核吞噬细胞在Aβ 清除方面发挥重要功能［3-5］。研究表明，AD 患者外周血单核细胞分化为吞噬细胞的能力下降，导致细胞更易凋亡和衰老。轻度认知功能障碍（mild cognitive impairment，MCI）是正常老化过程并向早期老年痴呆的一种过渡阶段，主要表现为轻度智能和记忆减退［4］。目前AD 及MCI的发生、发展及衰老过程中单核细胞中Aβ 吞噬功能的变化尚不清楚［5-7］。因此，本研究拟探讨AD 患者及MCI 患者血液中单核细胞的Aβ42 吞噬功能，以期阐明AD 在衰老发生发展过程中的作用机制，为AD的诊治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 收集2016年12月至2019年12月广西壮族自治区江滨医院收治的AD 患者（AD 组）、MCI患者（MCI组）和体检健康志愿者（NC组）各56例。入选标准：符合AD 及MCI 诊断的患者，MCI 及AD按美国国立语言障碍卒中研究所与AD 及相关疾病协会（NINCDS-ADRDA）标准诊断［8］，AD 存在持续进展的情景记忆障碍，超过6 个月。MCI 表现为轻度记忆力下降、智能减退，根据简易智能状态检测量（MMSE）和蒙特利尔认知评估量表（MoCA）评分标准，MMSE：21～26 分和MoCA：20～25 分；排除标准：严重心肺肾功能损伤者、合并急性单核细胞白血病、骨髓异常增生等血液类疾病者、存在免疫系统疾病者、严重感染者、其他原因引起认知功能障碍者。3 组间年龄、性别、既往史、血常规、血脂、血糖、甲状腺素、尿酸、尿素氮等实验室生化指标差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究通过广西壮族自治区江滨医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂与仪器 ELISA 试剂盒（美国Covance）；NovoCyteTM流式细胞仪（美国Bioscience）；离心机（德国Eppendorf）。

1.2 方法

1.2.1 单核细胞中Aβ42 吞噬功能测定 抽取静脉血10 ml，2 000 r/min 离心20 min，吸取上层血浆（备用），加淋巴细胞分层液，离心后收集外周血单个核细胞，加入RPMI1640 培养基中培养，加Aβ42-FTIC 抗体孵育过夜，弃上清，消化为单细胞，加PBS清洗3 次后离心，弃上清，加入带FITC 的二抗孵育30 min，在抗体染色前封闭20 min，洗涤后，加入100 μl FACS 洗涤液，再加入相应的CD14、CD16 抗体，4℃孵育30 min，4%多聚甲醛中固定细胞，流式细胞仪中进行单核细胞总Aβ42 荧光强度测定，根据CD14 和CD16 表达量可分为CD14+CD16-、CD14+CD16+和CD14-CD16+3 个亚群，最后获取各细胞亚群中内吞Aβ42 的荧光图，记录各单核细胞亚群的Aβ42表达的绝对值。

1.2.2 脑脊液及血液中Aβ42 的测定 收集所有研究对象血液中血浆及脑脊液标本，ELISA 法在酶标仪中测定Aβ42 浓度，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0软件进行统计学分析，计量资料采用表示，多组间比较采用单因素方差分析，LSD-t法进行两组间比较，采用Pearson相关分析验证血液、脑脊液中Aβ42 含量与单核细胞Aβ 吞噬功能的相关性，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血液单核细胞中Aβ42 的吞噬功能 经流式分析，可见单核细胞群前角散射（FSC-H）和侧角散射（SSC-H）（图1A），根据前角散射面积（FSC-A）和前向角散射高度（FSC-H）粘连细胞（图1B），可根据CD14和CD16 表达量不同计算出单核细胞亚群CD14+CD16-（图1C1）、CD14+CD16+（图1C2）和CD14-CD16+（图1C3）的绝对计数，与NC 组和MCI 组相比，AD 患者总单核细胞和单核细胞亚群（CD14+CD16-、CD14+CD16+和CD14-CD16+）的Aβ42 吞噬功能显著降低（P＜0.05），而MCI 组和NC 组间下降差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 血液单核细胞亚群的Aβ42功能比较（）Tab.1 Comparison of Aβ42 function of blood monocyte subsets（）

表1 血液单核细胞亚群的Aβ42功能比较（）Tab.1 Comparison of Aβ42 function of blood monocyte subsets（）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05.

图1 流式分析图Fig.1 Flow analysis diagram

2.2 不同年龄组AD 患者血液单核细胞中Aβ42 吞噬功能分析 根据20～45 岁、46～65 岁、和66～80 岁年龄度分组，随着年龄增长，AD 患者外周血总单核细胞和单核细胞亚群（CD14+CD16-、CD14+CD16+和CD14-CD16+）的Aβ42 吞噬功能明显降低（P均＜0.05），其中单核细胞亚群CD14+CD16-下降最为明显，见表2。

表2 不同年龄组AD患者外周血单核细胞的Aβ42功能（）Tab.2 Aβ42 function of peripheral blood monocytes in AD patients of different age groups（）

表2 不同年龄组AD患者外周血单核细胞的Aβ42功能（）Tab.2 Aβ42 function of peripheral blood monocytes in AD patients of different age groups（）

2.3 血液和脑脊液中Aβ42水平 与NC组和MCI组相比，AD 患者血液和脑脊液中Aβ42 水平明显降低（P＜0.05），MCI 组和NC 组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 血液和脑脊液中Aβ42水平比较（xˉ±s，pg/ml）Tab.3 Comparison of Aβ42 level in blood and cerebrospi⁃nal fluid（xˉ±s，pg/ml）

2.4 血液单核细胞Aβ42 与血液和脑脊液中Aβ42水平的相关性分析 Pearson 相关性分析表明，外周血中单核细胞亚群CD14+CD16-、CD14+CD16+与血液Aβ42 水平呈正相关（r=0.412，P=0.012；r=0.356，P=0.032），而与脑脊液Aβ42 水平无明显相关性（P＞0.05）；外周血中单核细胞CD14-CD16+亚群与血液和脑脊液中Aβ42水平的无明显相关性（P＞0.05）。

3 讨论

AD 主要表现为进行性记忆下降、神经认知功能障碍、精神行为异常等症状，65 岁以上人群高发，是一种呈渐进性进展、无法治愈的致命的神经退行性疾病，是导致老年痴呆的最常见原因。AD 的早期病理改变涉及大脑和视网膜中Aβ42 的积累，而Aβ42 淀粉样蛋白清除障碍是导致散发型AD 患者的主要原因［6，9-10］。脑内Aβ 的动态平衡除了与Aβ代谢调节有关外，还与外周血液及中枢神经系统的血脑屏障动态交换有关［9，11］。目前尚无特性治疗方法，而清除脑内Aβ 功能对AD 的治疗十分重要。目前有关单核细胞的Aβ 吞噬功能在MCI 及AD 中的具体作用机制尚不明确。因此，本研究初步探讨AD、MCI 和对照组患者中血液中单核细胞的Aβ42吞噬功能，为AD的诊治提供临床证据。

单核细胞等固有免疫系统与AD 的发生发展密切相关，单核细胞可参与机体防御，能有效识别、杀伤和清除病原菌、肿瘤细胞和死亡细胞［5-7］。另外，外周血单核细胞是组织抗原提呈细胞、成骨细胞及巨噬细胞的前体细胞，由骨髓象中髓单核干细胞分化并释放入血而来，通过细胞表面标志物（CD14 和CD16）表达差异可分为3 个细胞亚群，非经典型亚群：低表达CD14，高表达CD16（CD14-CD16+）、中间型亚群（CD14+CD16+），经典型亚群（CD14+CD16-）等单核细胞亚群［3，5］。本研究通过比较不同认知状态下血液中单核细胞Aβ 吞噬功能，发现与NC 组和MCI 组相比，AD 组总单核细胞群及单核细胞亚群CD14+CD16-、CD14+CD16+和CD14-CD16+的Aβ42 吞噬功能明显降低，而MCI 组和NC 组间各指标差异无统计学意义，提示AD患者血液中单核细胞的Aβ42吞噬功能下降，间接引起Aβ42 在脑内大量沉积，参与AD 的发生发展，而在MCI 阶段，外周血的单核细胞Aβ 吞噬功能并无明显下降。有研究表明，年龄与AD 的发生密切相关，随着年龄增长，AD 患病率逐渐增加，脑内Aβ42沉积越明显［10-11］。

本研究还发现，随着年龄增长，CD14+CD16-、CD14+CD16+和CD14-CD16+亚群Aβ42吞噬功能逐渐降低，说明单核细胞Aβ42 识别和吞噬功能随着年龄增长逐渐下降，提示在AD 衰老过程中血液单核细胞Aβ42 吞噬功能下降，是促进AD 患者Aβ42 在脑内沉积的主要原因之一［7，12］。另外，本研究表明血液和脑脊液中Aβ42 水平明显下降，在脑脊液中尤为明显，可能与AD 患者脑内Aβ42 大量沉积导致分泌在脑脊液和外周血中的Aβ42 减少有关，提示单核细胞Aβ42 吞噬功能的减弱，Aβ42 清除降低可进一步导致Aβ42 沉积，参与AD 发病的免疫调控机制［7］。

本研究中，CD14+CD16-和CD14+CD16+亚群的Aβ42 吞噬功能与血液Aβ42 水平呈正相关，而与脑脊液Aβ42 无明显相关性，表明单核细胞在外周血液中Aβ 的清除功能发挥重要作用，但对脑脊液的清除能力尚弱。Aβ清除包含中枢和外周途径，中枢途径是脑内Aβ 通过Aβ 降解酶降解和小胶质细胞吞噬，而外周途径是Aβ 经血脑屏障转运至外周血循环清除，外周血清除障碍可导致Aβ 沉积，加快AD 病程进展［9，11，13-15］。研究发现，AD 患者外周单核细胞在外周血循环和脑内Aβ 清除功能上发挥重要作用，其可能机制是患者脑内的Aβ 从血脑屏障通过低密度脂蛋白受体相关蛋白-1（LRP1）转运至外周血循环，外周血循环Aβ 通过糖基化终产物受体（RAGE）转运至脑内，而外周血循环中Aβ 的清除能力能间接影响脑内Aβ 水平［9-10，16-17］。本研究中脑脊液Aβ 水平可间接反映脑内Aβ 水平，因此今后需进一步探讨血液单核细胞Aβ42 吞噬功能如何对脑内Aβ42 沉积产生影响，为阐明Aβ 清除及沉积的机制提供较为充足的理论证据。

综上，AD 患者血液中单核细胞的Aβ42 吞噬功能下降，随着年龄增长，AD 患者外周血总单核细胞和单核细胞亚群（CD14+CD16-、CD14+CD16+和CD14-CD16+）的Aβ42 吞噬功能明显降低，进而导致血液和脑脊液中Aβ42 水平沉积明显升高，脑脊液中Aβ42 沉积更为明显，引起脑脊液和血液中游离Aβ42水平降低，且血液中CD14+CD16-和CD14+CD16+亚群的Aβ42 吞噬功能与血液Aβ42 水平沉积呈正相关，提示外周血单核细胞Aβ42 吞噬功能下降在AD 发病机制中发挥重要作用，为AD 的诊治提供了新的潜在靶点。