五味子乙素通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路减轻PD 小鼠炎症反应及DA能神经元凋亡①

贾 璐 杭 薇 徐幸杰 王 青 李彦青 秦劭晨 张海飞 樊慧杰 柴 智 马存根（山西中医药大学神经生物学研究中心，晋中 030619）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一种以中脑黑质多巴胺（dopamine，DA）能神经元进行性变性缺失为主要病理表现的神经退行性疾病，主要的临床症状包括静止时震颤、运动迟缓、僵直和姿势不稳定。虽然PD 的发病原因及发病机制尚未完全明晰，但来自PD 患者和动物模型的大量证据提示，炎症反应参与了PD 的神经变性过程［1-2］。研究表明，Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）作为一条与免疫症性反应有关的经典信号通路，可调控免疫应答促进PD的发病进程［3］。

传统中药五味子具有收敛、生津、滋补之功效，五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是五味子中的一种活性单体，属于联苯环辛烯类木脂素，具有亚甲二氧基结构（化学结构式见图1），表现出抗炎、抗氧化、抗凋亡等广泛的药理作用［4-6］。但Sch B 能否改善1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）诱导的PD小鼠神经元损伤仍是未知。在此，本研究利用MPTP 诱导的小鼠作为PD 动物模型，探究Sch B 的神经保护作用，并基于炎症反应和TLR4/NF-κB 信号通路探讨其可能机制。

图1 Sch B化学结构式Fig.1 Chemical structure of Sch B

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8～10 周龄雄性C57BL/6 小鼠（体质量20～25 g）购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0006。在标准动物饲养室内（室温：23±1℃，相对湿度：40%～60%）适应性饲喂1周。

1.1.2 试剂与仪器 Sch B（成都曼斯特生物科技有限公司，货号：A0204）；MPTP（美国Sigma-Aldrich公司，货号：23007-85-4）；IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，货号ml301814、ml002293、ml002095）；TH 抗体和Alexa Fluor 594 标记山羊抗兔IgG 二抗（美国Abcam 公司，货号：ab6211、ab150080）；Bcl-2、Bax 与p-NF-κB p65抗体（美国Cell Signaling Technology 公司，货号：D17C4、D3R2M、S536）；TLR4抗体（中国武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号：WH114312）；β-actin 抗体（美国Bioworld 公司，货号：AP0060）；HRP 羊抗兔IgG 二抗（武汉博士德生物工程有限公司，货号：BA1054）。

1.1.3 仪器 冰冻切片机、倒置荧光显微镜（德国Leica 公司）；全波长酶标仪（美国Thermo 公司）；电泳仪、转膜仪、凝胶成像分析仪（美国Bio-Rad 公司）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与造模 30 只雄性小鼠随机分为3组：正常组、模型组和Sch B组，每组10只。模型组和Sch B 组小鼠腹腔注射MPTP 制备PD 模型，注射剂量如下：第1天25 mg/kg，第2天20 mg/kg，第3～7天均为30 mg/kg，正常组注射等量生理盐水［7］。从造模第一天起，Sch B 组小鼠给予80 mg/（kg·d）Sch B灌胃［8］，模型组和正常组小鼠予以等体积0.5%羧甲基纤维素钠灌胃，灌胃持续14 d。

1.2.2 步态分析 采用DigiGait 动物步态检测分析系统记录各组小鼠连续10 s 内的步态行为，用步幅和步宽评价小鼠运动平衡协调性，每只小鼠测试3 次取平均值，每次间隔10 min 以上。每次测试完毕用乙醇清除气味，避免干扰。

1.2.3 样本制备 10%水合氯醛（0.2 ml/只）腹腔注射麻醉小鼠后，用生理盐水进行心脏灌注。每组随机取5 只小鼠用4%多聚甲醛固定，分离脑组织，经脱水、OCT 包埋后进行低温切片（厚度为10 μm），切片用于免疫荧光染色。各组其余5只小鼠冰上取中脑黑质用于ELISA及Western blot检测。

1.2.4 免疫荧光染色检测TH 取脑切片于PBS中浸泡15 min，加入TH抗体4℃孵育过夜，次日用PBS冲洗5 min×3 次，加入Alexa Fluor 594 标记二抗于水平摇床上室温孵育2 h，PBS 冲洗5 min×3 次，50%甘油封片，荧光显微镜下观察、拍照（100倍）。

1.2.5 ELISA 检测黑质区IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平 取小鼠脑黑质在冰上用生理盐水制备10%组织匀浆液，2 000 r/min 离心15 min，离心半径10 cm，取上清，按照试剂盒说明书测定各组小鼠脑黑质中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

1.2.6 Western blot 检测黑 质区TH、Bcl-2、Bax、TLR4、p-NF-κB p65 表达取小鼠脑黑质称重，按照重量∶体积=1∶9 加入RIPA 裂解液，利用组织匀浆器在冰上提取蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。各组蛋白经SDS-PAGE 凝胶电泳分离后湿转至PVDF 膜，5%脱脂奶室温封闭1 h，TH、Bcl-2、Bax、TLR4、p-NF-κB p65 和β-actin 一抗4℃孵育过夜。次日用PBS 洗膜3 次，室温孵育二抗2 h，化学发光液显影，用Image J软件进行灰度值分析。

1.3 统计学分析 采用GraphPad Prism 5.0 软件进行数据分析，数据以表示，两两比较使用Tukey 检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠步态分析及比较 步态分析结果显示，与正常组相比，模型组小鼠左前爪步幅显著减小（P＜0.01），后爪步宽显著增大（P＜0.01）；与模型组比较，Sch B 组小鼠左前爪步幅明显增大（P＜0.05），后爪步宽显著减小（P＜0.05，图2）。

图2 各组小鼠步幅及步宽比较Fig.2 Comparison of stride length and stance width of mice in each group

2.2 各组小鼠黑质区TH 表达比较 免疫荧光染色和Western blot 结果显示，与正常组相比，模型组小鼠黑质区TH 荧光强度明显减弱（P＜0.01），TH 蛋白表达显著减少（P＜0.001）；与模型组相比，Sch B组TH 荧光强度显著增强（P＜0.05），TH 蛋白表达明显增加（P＜0.05，图3）。

图3 各组小鼠黑质区TH荧光强度及蛋白表达比较（×100）Fig.3 Comparison of fluorescence intensity and expression level of TH in substantia nigra of mice in each group（×100）

2.3 各组小鼠黑质区IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平比较 ELISA结果显示，模型组小鼠黑质区IL-1β、IL-6和TNF-α 水平均显著高于正常组（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01）；与模型组相比，Sch B组TNF-α、IL-6和IL-1β的表达显著降低（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01，图4）。

图4 各组小鼠黑质区IL-1β、IL-6和TNF-α水平比较Fig.4 Comparison of levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in substantia nigra of mice in each group

2.4 各组小鼠黑质区Bcl-2、Bax蛋白表达比较 与正常组相比，模型组小鼠黑质区Bcl-2表达显著减少（P＜0.001），Bax表达明显增加（P＜0.001），Bcl-2/Bax降低（P＜0.01）；Sch B 组小鼠黑质区Bcl-2 表达显著升高（P＜0.05），Bax 表达明显降低（P＜0.01），Bcl-2/Bax升高（P＜0.05，图5）。

图5 各组小鼠黑质区Bcl-2、Bax蛋白表达比较Fig.5 Comparison of expression levels of Bcl-2 and Bax in substantia nigra of mice in each group

2.5 各组小鼠黑质区TLR4、p-NF-κB p65蛋白表达比较 与正常组相比，模型组小鼠黑质区TLR4 和p-NF-κB p65 表达显著升高（P＜0.05、P＜0.001）；经Sch B 干预后，TLR4 和p-NF-κB p65 表达显著降低（P＜0.01、P＜0.01，图6）。

图6 各组小鼠黑质区TLR4、p-NF-κB p65蛋白表达比较Fig.6 Comparison of expression levels of TLR4 and p-NF-κB p65 in substantia nigra of mice in each group

3 讨论

PD作为全球发病率第二的神经退行性疾病，目前临床治疗主要是通过恢复DA 活性来进行症状改善，但尚无药物或疗法能够解决进行性神经退行性变。中医将PD 归类于“颤病”范畴，认为PD 是由于肝肾亏虚致使筋脉失养而出现的一类疾病，补肾养肝、益气养血能够有效改善PD 的临床表现［9］。五味子具有补肾、益气之功效，含有五味子的方剂已在临床用于PD 治疗［10］。五味子的主要药用成分是木脂素，Sch B 是五味子木脂素中活性最强的一种，也是五味子中最主要的活性物质，因此，虽未有Sch B直接治疗帕金森病患者的报道，但五味子在临床中对帕金森病的治疗作用可能与Sch B 有关。研究发现，Sch B具有良好的神经保护作用，Sch B可通过抗凋亡、抗氧化途径改善阿尔兹海默病小鼠的学习记忆能力，并抑制海马区炎症和氧化应激继而缓解大鼠的抑郁行为［4，11-12］。此外，Sch B 对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用也与其抑制炎症反应有关［5］。本研究观察到Sch B 能够增大MPTP 所致PD 小鼠的步幅，并减小步宽，说明Sch B 可有效改善PD 小鼠的运动协调能力。TH 是一种表达于DA 能神经元中的DA 合成限速酶，随着DA 能神经元退行性丢失，TH 的含量会同时减少［13］。本研究结果显示，PD小鼠黑质区TH 荧光强度及蛋白表达明显降低，而经Sch B 治疗后显著上调，说明Sch B 能够有效减少DA 能神经元丢失，对MPTP 诱导的PD 小鼠同样具有神经保护作用。

PD的发病机制复杂，目前认为是多种病理过程互相交织作用的结果。大规模的流行病学研究结果显示，长期服用非甾体抗炎药NSAID 能够显著降低帕金森病的发病率［14］；此外，在PD 患者和动物模型的黑质区，均检测到小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，以及大量促炎细胞因子的释放，提示神经炎症参与了PD的发生或进展［15］。TLR4/NF-κB是一条经典的炎症相关信号通路，TLR4 的活化会导致NF-κB 由细胞质进入细胞核，启动下游基因转录程序。小胶质细胞和星形胶质细胞是中枢神经系统中参与免疫反应的两类重要细胞，当其TLR4/NF-κB通路被激活后，会释放大量促炎细胞因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等，从而产生炎症微环境损伤神经元。研究显示，在MPTP 诱导的PD 小鼠脑内，存在TLR4的 上调 表达 以及NF-κB 活 化［3］。通 过观 察缺 失TLR4 基因的PD 小鼠，发现其表现出更轻的运动功能障碍、更弱的神经炎症反应以及更少的DA 能神经元丢失［16］。因此，抑制TLR4/NF-κB 炎症信号通路成为多种药物保护DA 能神经元的作用靶点［17-18］。事实上，Sch B抑制炎性反应的作用已经在多种疾病模型中得到证实，其中，Sch B 对哮喘小鼠肺部损伤的改善，以及对LPS 处理的小鼠巨噬细胞的保护作用均是通过抑制TLR4/NF-κB 通路实现的［19-20］。本研究检测到PD 小鼠黑质区的IL-1β、IL-6 和TNF-α水平显著升高，经Sch B干预后均明显下调，表明Sch B能够有效抑制PD 小鼠黑质区的炎症反应。进一步研究发现，与模型组相比，Sch B 组小鼠黑质区TLR4 和p-NF-κB p65 蛋白表达量显著减少，说明Sch B 能够抑制TLR4/NF-κB 信号通路，继而减少促炎细胞因子表达，缓解DA能神经元的炎症损伤。

细胞凋亡是DA 神经元丢失的重要方式［21］。Bcl-2作为一种重要的抗凋亡蛋白，可通过多种途径抑制凋亡发生；Bax 则是一种促凋亡分子，在凋亡和中枢神经系统损伤中起重要作用，Bcl-2 与Bax 表达的比值影响着细胞的最终结局［22］。在MPTP 诱导的PD 模型小鼠中，Bcl-2/Bax 会减少，细胞凋亡被激活［23］。有趣的是，研究发现神经胶质细胞分泌的促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α 可通过多种途径启动神经元凋亡，其中，TNF-α 的促凋亡作用与调节Bcl-2 家族蛋白表达密切相关［24］。本研究观察到Sch B 不仅能够抑制IL-1β、IL-6 和TNF-α 的产生，还能逆转Bcl-2 与Bax 在PD 小鼠黑质区的表达，增加Bcl-2/Bax 比值，抑制细胞凋亡的发生。由此推测，Sch B对PD小鼠的抗凋亡作用可能与抑制炎症因子释放有关，但是否有其他凋亡相关信号通路参与了这一过程仍有待进一步研究。

综上所述，Sch B 能够有效改善PD 小鼠的运动功能障碍与DA 能神经元丢失，这可能与抑制TLR4/NF-κB 信号通路，减少黑质区炎症反应继而缓解神经元凋亡有关。