6-姜烯酚介导Hedgehog/Gli1通路对三阴性乳腺癌细胞侵袭及迁移作用机制

林嘉怡，柯乔丹，吴锦如，李梦杰，黄 霞，胡晨霞

(广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006)

乳腺癌是中国女性最为常见的恶性肿瘤，其中三阴性乳腺癌是乳腺癌的一种分子亚型，特征为雌激素受体、孕激素受体及原癌基因Her-2均为阴性。临床常采用靶向药物辅助化疗及放疗进行治疗，但三阴性乳腺癌因其转移率高，复发性强，预后差而较难取得良好的治疗效果[1]。Hedgehog(Hh)信号通路激活已被证实可促进乳腺癌生长、侵袭迁移及耐药[2]，Hh/Gli信号通路是一条经典的胚胎发育信号通路，Gli作为Hh通路下游转录因子，由Gli1、Gli2、Gli3组成，其异常激活可启动下游多种与肿瘤相关基因的转录，从而影响肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭转移。有报道Hh通路异常激活会促进胰腺癌细胞增殖，并提高其侵袭迁移能力[3]。同时还有研究发现，Gli1高表达乳腺癌患者预后差于低表达患者，且耐药性更强[4]。因Hh通路对乳腺癌的增殖、凋亡存在影响，Gli1作为Hh通路下游转录因子，在通路激活中起到重要作用，而Gli1是否是三阴性乳腺癌治疗靶点尚不明确。6-姜烯酚(6-Shogaol)是中药干姜中含量最丰富的成分，传统中医药理论认为干姜性热味辛，具有温中散寒、回阳通脉、温肺化饮等功效[5]。其温热、辛散之性有利于行气活血，对于因阳气虚弱、寒凝阻滞所致肿瘤有较好疗效[6]。历代医家常运用活血化瘀、温肺化饮类中药治疗乳腺癌[7]，现代药理研究也发现6-姜烯酚可抗炎、抗氧化，对多种肿瘤细胞增殖具有抑制作用[8]。

本课题以Hh通路转录因子Gli1基因为研究靶点，应用慢病毒过表达Gli1及抑制剂Gant61降低Gli1表达，检测Gli1异常表达对三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移能力影响。并进一步研究6-姜烯酚介导Hh/Gli1通路对MDA-MB-231增殖、侵袭及迁移能力的影响，初步探究其作用靶点及机制，为运用6-姜烯酚降低三阴性乳腺癌复发转移、提高患者生存质量提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞人乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自上海中乔新舟公司。

1.2 药物及试剂6-姜烯酚(纯度≥90%),上海阿拉丁公司批号：G101239；Gant61(批号：G9084)、DMSO(批号:D2650)均购自美国SIGMA公司；CCK-8检测试剂盒，美国Glpbio公司，批号GK1001；Matrigel基质胶，美国Corning公司，批号：354246；EdU试剂盒，APExBIO公司，批号：K1075113417951；HBLV-ZsGreen-PURO过表达对照病毒(Lv-NC)、HBLV-h-GLI1-3xflag-ZsGreen-PURO Gli1过表达病毒(Lv-Gli)，汉恒生物有限公司；Gli1(批号：#3538)、Vimentin(批号：#3390)、YAP(批号:#14074)、β-actin(批号:#4970)均购自美国CST公司；TEAD4，英国Abcam公司，批号:ab58310。

1.3 仪器二氧化碳培养箱(上海力申有限公司)；超净工作台(苏州净化科技有限公司)；EnSpire酶标仪(美国PerkinElmer公司)；倒置显微镜(Motic公司)；全自动化学发光图像分析(Canon公司)；变性梯度凝胶电泳(BIO-RAD公司)。

1.4 细胞培养人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231用含有1%青霉素链霉素溶液，10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。待细胞融合度为80%～90%时用0.5%胰酶消化3 min，收集后离心进行传代。

1.5 细胞转染与分组收集对数生长期的MDA-MB-231贴壁细胞接种于6孔板，每孔2.0×105个细胞，待d 2融合度约为60%时，根据LipofectamineTM2000转染试剂说明将HBLV-ZsGreen-PURO过表达对照病毒(Lv-NC)、HBLV-h-GLI1-3xflag-ZsGreen-PURO Gli1过表达病毒(Lv-Gli)分别转染入MDA-MB-231细胞中。实验分组分别为：阴性对照组(Lv-NC)，Gli1抑制剂组(Gant61)，过表达Gli1 MDA-MB-231稳转细胞株组(Lv-Gli)，及Lv-NC+6-姜烯酚组(Shogaol)、Lv-NC+Gant61+6-姜烯酚组(Gant61+Shogaol)、Lv-Gli+6-姜烯酚组(Lv-Gli+Shogaol)。

1.6 CCK-8实验检测Gant61及6-姜烯酚对MDA-MB-231细胞活性的影响将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞接种于96孔板中，每孔5.0×103个细胞，置于培养箱中继续培养24 h后分别加入0、5、10、20、40、60、80、100 μmol·L-1的6-姜烯酚或0、1、5、10、20、30、40 μmol·L-1的Gant61，给药24 h后采用CCK-8法在450 nm检测细胞的吸光度，测定存活率，确定后续用药浓度。取各组细胞Lv-NC组、Gant61组、Lv-Gli组、Shogaol组、Gant61+Shogaol组、Lv-Gli+Shogaol组接种于96孔板中，每组6个复孔，每孔5.0×103个细胞，100 μL细胞悬液，24、48、72 h后,更换含有9% CCK-8溶液的110 μL培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中孵育2～3 h后于酶标仪检测450 nm的吸光度值。

细胞存活率/%=[(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

1.7 EdU实验检测6-姜烯酚对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响取各组细胞Lv-NC组、Gant61组、Lv-Gli组、Shogaol组、Gant61+Shogaol组、Lv-Gli+Shogaol组分别给药24 h后，分别消化离心，重新接种于12孔板中，每孔接种1.8×105个细胞，并在孔板中放入爬片，置于培养箱中培养24 h后加入1×EdU储存液后继续孵育细胞2 h，PBS洗涤3次后，加入含3.7%甲醛的PBS，室温下固定15 min，再用PBS洗涤2次后加入含0.5% Triton的PBS，室温下孵育20 min。用PBS洗涤3次后加入Click反应液室温避光孵育30 min，用PBS洗涤3次后加入1×Hoechst 33342溶液室温避光孵育30 min，PBS洗涤3次后用抗荧光淬灭剂将爬片封片于载玻片上在荧光显微镜下观察并拍照记录。

1.8 细胞划痕实验及Transwell实验检测6-姜烯酚对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响细胞划痕及Transwell实验分组如下：Lv-NC组、Gant61组、Lv-Gli组、Shogaol组、Gant61+Shogaol组、Lv-Gli+Shogaol组。取Lv-NC及Lv-Gli细胞分别接种于6孔板中，每组3个复孔，每孔1.5×106个细胞，2 mL培养基。待细胞贴壁生长至80%～90%后，应用10 μL枪头于每个孔的细胞间垂直刮擦形成划痕，用PBS洗涤2次后于倒置显微镜下拍照记录划痕的区域大小。ImageJ软件分析图像中划痕面积后计算并比较划痕愈合率，划痕愈合率/%=[(0 h划痕面积-观察时间点划痕面积)/0 h划痕面积]×100%。Transwell实验分组如上，取各组细胞进行药物处理24 h后，分别消化离心，PBS清洗2次后用无血清培养基接种于Transwell小室中，每室3×104个细胞，200 μL，下室给予600 μL完全培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后用PBS清洗上下室，下室用600 μL 4%甲醇固定20 min后用结晶紫染色，于倒置显微镜中拍照记录细胞迁移情况。

1.9 Transwell实验检测6-姜烯酚对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响实验分组如下：Lv-NC组、Gant61组、Lv-Gli组、Shogaol组、Gant61+Shogaol组、Lv-Gli+Shogaol组。将Matrigel胶用无血清培养基以1 ∶8比例稀释后取30 μL铺于Transwell小室上室。置于37 ℃培养箱凝固30 min后，取药物处理24 h后各组细胞消化离心用PBS清洗2次，取4.0×104个细胞用无血清培养基接种于上室，每室200 μL，下室给予600 μL完全培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h后用棉签清洗上室，用PBS清洗2次后，应用4%甲醛固定，用结晶紫染色后倒置显微镜下拍照记录细胞侵袭情况。

Fig 1 Establishment of stable Gli1-overexpressing MDA-MB-231 cell line n=5)

1.10 Western blot实验检测6-姜烯酚对MDA-MB-231细胞Hh信号通路等相关基因蛋白表达情况的影响收集各组细胞(Lv-NC组、Gant61组、Lv-Gli组、Shogaol组、Gant61+Shogaol组、Lv-Gli+Shogaol组)，每5.0×106个细胞加入含1% PMSF的100 μL RIPA细胞裂解液冰上裂解后4 ℃、15 000 r·min-1离心15 min后取上清加入5× loading buffer及RIPA调整蛋白浓度为2 g·L-1，每孔蛋白上样量为10 μL，经SDS-PAGE电泳分离转移至PVDF膜后应用5%牛奶封闭2 h，TBST清洗3次后用一抗4 ℃孵育12～16 h，TBST清洗3次后用相应二抗室温孵育1 h，TBST清洗3次后用ECL发光液于全自动发光仪上显影观察蛋白表达情况。

2 结果

2.1 稳定过表达Gli1细胞株的建立采用人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞稳转慢病毒，成功建立对照组Lv-NC及过表达组Lv-Gli细胞株(Fig 1)。荧光显微镜下两种细胞呈现绿色荧光，且Lv-Gli细胞形态较Lv-NC细胞更细长，呈间质表型特征。荧光定量qRT-PCR实验检测两组细胞中Gli1的mRNA表达水平，结果显示Lv-Gli细胞中Gli1 mRNA表达水平为Lv-NC细胞的200倍左右，数据差异具有显著性(P<0.01)。Western blot实验结果显示,Lv-Gli细胞Gli1蛋白表达水平高于Lv-NC细胞。表明过表达Gli1 MDA-MB-231稳转细胞株Lv-Gli建立成功。

2.2 CCK-8实验检测Gant61及6-姜烯酚对细胞活性的影响CCK-8实验检测应用不同浓度的Gant61或6-姜烯酚处理MDA-MB-231细胞24 h后细胞存活率的变化，确定后续实验所采用的用药浓度。结果表明Gant61对MDA-MB-231细胞的IC50为16.40 μmol·L-1,6-姜烯酚对MDA-MB-231细胞的IC50为35.22 μmol·L-1。细胞存活率随用药浓度升高而降低，呈浓度依赖性(Fig 2)。据此结果，选取Hh/Gli抑制剂Gant61 20 μmol·L-1作为后续用药浓度以充分发挥抑制作用，6-姜烯酚根据IC50选取30 μmol·L-1作为后续用药浓度。CCK-8实验结果显示经Gant61处理，Gli1表达受到抑制后，Lv-NC组存活率随时间延长而降低，呈时间依赖性(Fig 3)。经6-姜烯酚处理24 h后，Lv-NC组及Lv-Gli组细胞存活率均降低，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。结果表明，MDA-MB-231细胞中Gli1表达受到抑制时细胞活性降低，经6-姜烯酚处理后，各组细胞活性均有不同程度下降。

Fig 2 Effects of Gant61 and 6-Shogaol on cell viability of MDA-MB-231 cells at 24 h assessed by CCK-8 assay n=5)

Fig 3 Cell viability of cells in each group at 24,48 and 72 h assessed by CCK-8 n=5)

2.3 EdU实验检测6-姜烯酚对细胞增殖能力的影响应用Gant61抑制Gli1表达时，细胞增殖能力降低，Lv-NC组及Gant61组增殖率分别为(51.67±0.04)%及(48.99±0.03)%，差异有统计学意义(P<0.05)。6-姜烯酚处理Lv-NC组及Lv-Gli组时，细胞增殖率为(43.35±0.02)%及(37.86±0.06)%，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。6-姜烯酚处理Gant61组时细胞增殖能力抑制效果更强，细胞增殖率为(32.59±0.05)%，差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明，当Gli1表达受到抑制时，MDA-MB-231细胞增殖能力下降；6-姜烯酚对过表达Gli1基因MDA-MB-231稳转细胞增殖能力具有显著抑制作用。

2.4 6-姜烯酚对细胞迁移能力的影响细胞划痕实验结果显示，Lv-NC组、Gant61组、Lv-Gli组、Shogaol组、Gant61+Shogaol组、Lv-Gli+Shogaol组给药48 h后各组细胞迁移率分别为(41.95±3.73)%、(12.93±4.24)%、(88.86±5.29)%、(32.62±4.49)%、(10.75±3.04)%、(68.75±5.02)%(Fig 5)。Transwell实验结果显示，Lv-NC组、Gant61组、Lv-Gli组、Shogaol组、Gant61+Shogaol组、Lv-Gli+Shogaol组给药24 h后各组细胞穿透膜的数量分别为66±3、39±9、107±5、4±3、2±1、85±6个(Fig 6)。结果显示在MDA-MB-231细胞中Gli1基因过表达时细胞迁移能力增强(P<0.01)，Gli1表达被抑制时细胞迁移能力减弱(P<0.01)。经姜烯酚处理可抑制过表达组细胞的迁移能力(P<0.01)。

Fig 4 The proliferation ability of cells in each group detected by EdU assay n=3,×100)

2.5 6-姜烯酚对细胞侵袭能力的影响Transwell实验结果显示，Lv-NC组、Gant61组、Lv-Gli组、Shogaol组、Gant61+Shogaol组、Lv-Gli+Shogaol组给药24 h后各组细胞穿透膜的数量分别为280±9、191±10、335±6、139±11、3±1、170±20个(Fig 7)。在MDA-MB-231细胞过表达Gli1基因后，侵袭能力增强(P<0.01)；当Gli1表达受到Gant61抑制，侵袭能力减弱(P<0.01)。Lv-Gli组经6-姜烯酚处理后，侵袭能力下降，且6-姜烯酚处理Gant61组时抑制细胞侵袭能力效果增强(P<0.01)。

Fig 5 The migration ability of cells in each group assessed by wound healing n=5,×400)*P<0.05,**P<0.01 vs Lv-NC;##P<0.01 vs Lv-Gli

2.6 6-姜烯酚对相关基因蛋白表达的影响Western blot实验结果显示(Fig 8)，Lv-Gli组Gli1、Vimentin及Hippo通路基因YAP、TEAD4表达均升高(P<0.01)，但SMO基因表达水平未受影响，可能与SMO为Hh通路上游基因有关；Gant61组相关蛋白表达均降低(P<0.01)。应用6-姜烯酚处理Lv-Gli组后，Gli1等基因表达受到抑制，且Gant61+6-Shogaol组基因蛋白表达抑制情况比Gant61组更强，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。结果提示，6-姜烯酚可能通过抑制Hedgehog及Hippo通路关键基因从而影响乳腺癌细胞EMT进程，值得进一步深入研究。

Fig 6 The migration ability of cells in each group assessed by

Fig 7 The invasion ability of cells in each group assessed

Fig 8 The Gli1,Vimentin,YAP,TEAD4 protein expression examined by Western blot n=3)

3 讨论

三阴性乳腺癌因其侵袭及迁移能力强，复发率高预后差而成为乳腺癌中较难攻克的一种分子亚型。据世界卫生组织2021年最新发布数据，乳腺癌已超过肺癌成为世界第一大癌[9]。Hh信号通路与乳腺癌发生、发展、转移相关，当其异常激活时容易导致癌症发生，促进乳腺癌细胞增殖及提高侵袭迁移能力。Gli作为Hh通路下游转录因子，有研究表明乳腺癌细胞增殖能力增强时Gli1表达升高[10]。目前药理研究也发现6-姜烯酚具有抗炎、抗氧化，对多种肿瘤细胞增殖具有抑制作用[11]。由于Hh通路转录因子Gli与乳腺癌发生发展密切相关，且有研究显示，6-姜烯酚对肿瘤有抑制作用，但Gli1基因是否介导三阴性乳腺癌细胞增殖侵袭迁移，6-姜烯酚是否以Hh/Gli通路作为靶点抑制三阴性乳腺癌细胞发生发展尚不明确。

本研究表明，Gli1经慢病毒转染细胞过表达后可促进三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭迁移能力，并可判断Gli1介导三阴性乳腺癌细胞的侵袭迁移能力。Gant61作为Gli1的抑制剂，有研究发现Gant61可通过调控自噬能力而抑制乳腺癌细胞增殖[12]，本研究应用Gli抑制剂Gant61下调Gli1表达后细胞增殖侵袭迁移能力下降。经6-姜烯酚处理过表达Gli1组细胞增殖侵袭迁移能力下降，表明6-姜烯酚能够通过降低Gli1基因表达抑制MDA-MB-231细胞侵袭迁移能力。

Western blot实验结果表明当过表达Gli1基因，MDA-MB-231细胞Hh通路基因Gli1，EMT标志基因Vimentin，Hippo通路关键基因YAP、TEAD4表达升高，抑制剂Gant61处理后，上述相关基因表达降低。表明Gli1基因可能与Hippo通路及EMT进程有关，在此基础上，我们应用6-姜烯酚处理各组细胞，上述基因表达降低，说明6-姜烯酚能抑制Hh通路、Hippo通路及EMT关键基因从而抑制细胞侵袭迁移能力。同时，我们发现Gli1基因过表达或抑制时Hh通路上游基因SMO未见明显变化。

Hippo信号通路在调控细胞及器官生长，肿瘤发生起重要作用，有报道该通路与乳腺癌的发生发展及耐药密切相关[13]。本实验发现，Gli1过表达影响了YAP的蛋白表达水平，可能两者之间存在串扰关系。YAP及TEAD4分别是Hippo通路上的转录共激活因子及转录因子，当YAP在人类癌症中异常激活时，TEAD4可诱导独立于YAP的肿瘤细胞侵袭和迁移，这表明TEAD4是一个潜在治疗靶点[14-15]。鉴于Hh/Gli与Hippo/TEAD4信号通路之间的相关性及在肿瘤发生和转移中的重要作用，进一步探讨6-姜烯酚是否靶向Gli1/TEAD4交叉对话对预防和治疗三阴性乳腺癌具有重要意义。