HP亚甲蓝染色改良法分析

张淑正，张效娟，张占蛟

幽门螺杆菌(helicobacter pylori, HP)是主要存在于胃黏膜上皮和胃腺体黏膜之间的一种细菌，是短杆状、两端微弯的革兰阴性杆菌。HP与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等关系密切。随着免疫组化和分子病理技术的迅猛发展，部分病理学检查中常用的特殊染色方法和项目渐渐被取代或作用被弱化，但显示HP的特殊染色方法仍然被广泛应用，且其特染方法种类较多，其中以亚甲蓝染色法的HP阳性检测率相对较高[1-2]。我科室长期对亚甲蓝染色法检测HP进行深入探索和实践，并在操作细节上进行改进，找到了一种提升HP切片染色质量的简便方法，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集2021年6月5日～6月20日南京金域医学检验所有限公司病理科胃镜活检标本100例，均经10%中性福尔马林固定4～8 h。行常规活检取材，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋。每例标本均制作成1个蜡块，每个蜡块制成3 μm厚白片2张，其中1张设为实验组(100张)；另1张设为对照组(100张)。

1.2 染液配制亚甲蓝染液：亚甲蓝0.5 g，硼酸0.5 g溶于100 mL蒸馏水中，充分溶化后，加入亚甲蓝0.5 g，再次充分混匀溶化。

1.3 方法

1.3.1传统方法 切片脱蜡至水，自来水冲洗，置于亚甲蓝染液中浸染5 min，自来水洗净，吹风机冷风吹干，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.3.2改良法 切片脱蜡至水，自来水冲洗，置于亚甲蓝染液染缸中时，旋转染色架30 s，再静止于染缸中浸染4.5 min，自来水洗净，高浓度梯度乙醇(95%、100%、100%)快速脱水各10 s，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.3.3操作步骤 (1)两组切片以同样条件进行前处理：70 ℃恒温烤箱烤片20 min，二甲苯Ⅰ和Ⅱ各5 min，梯度乙醇(100%、95%、90%、85%、75%)脱二甲苯至水，自来水冲洗。(2)对照组使用传统方法操作进行染色，实验组使用改良法操作进行染色。

2 结果

100例标本分成的两组切片合计200张，均经两名高年资病理医师采用双盲法阅片。(1)两种方法之间的诊断结果一致性比较：对照组HP阳性43例，阴性57例；实验组HP阳性43例，阴性57例。结果显示：对照组与实验组的HP阳性率诊断结果完全一致。(2)两种方法之间的切片质量差异比较：对照组切片透明度一度，背景清洁度一般，见大量散在、弥漫强折光紫黑色小点污染(图1)；实验组切片透明度良好，背景清洁，无散在折光小点污染(图2)。结果显示：两者在切片质量上差异有显著性，改良法优于传统方法。

图1 传统方法染色：切片透明度一度，背景清洁度一般，见大量散在、弥漫强折光紫黑色小点污染 图2 改良法染色：切片透明度良好，背景清洁，无散在折光小点污染

3 讨论

HP与消化道多种疾病的发生相关，临床诊疗过程中常需行HP检测。组织学活检中，胃镜活检组织使用HE染色不易使HP着色，诊断难度大，需使用特殊染色或免疫组化染色才能清晰地显示HP，从而明确诊断。

HP的检测方法有多种，组织学检查中有W-S银染色法、Giemsa染色法、亚甲蓝染色法[3]、BASO染色法[4]、快速尿素酶法[2]、免疫组化法等。亚甲蓝法又称硼酸美蓝法，其原理是亚甲蓝可溶于水，电离成有色的阳离子，与带阴离子的HP相结合着蓝色[3]。该方法检测HP阳性率高，操作步骤简单，试剂来源方便，价格便宜，染液使用寿命长，染色结果可靠，被各医院病理科广泛应用。传统的亚甲蓝法在染色完成后，未进行脱水处理，直接吹风机吹干或自然晾干后封固，导致切片透明度不足，组织上常布满强折光紫黑色小点或类晶体样物，增加了诊断难度。

本科室在多年的探索过程中，发现亚甲蓝染液随着静止时间的延长，其染液缸底部逐渐产生沉淀物，随着沉淀物产生的增多，其染色效价开始下降，从而使HP阳性率降低。我科室通过在染色前或染色时进行染液的充分混匀，可使沉淀物重新溶化于染液中，促使染色效价开始回升，HP阳性率得到提升；同时发现此时使用高浓度乙醇(95%、100%)进行脱水，并不会洗脱或极少洗脱已结合于HP上的染料，其着色强度与传统方法差异无显著性；而经过高浓度乙醇(95%、100%)脱水后的组织切片再经二甲苯透明，可使组织切片在整个实验过程中均保持湿润状态，组织和细胞未暴露在空气中，其切片透明度比传统方法显著提升，且组织上无干扰诊断(甚至可能引起误诊)的强折光小点样物，无“碳核”现象。