弥漫大B细胞淋巴瘤中STAT5A的表达及意义

缪小兵，徐小红，周 颖，吉莉莉，陶 赟，何 松

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是一组最常见的淋巴瘤亚型，在生物学、病理学以及临床特征等多方面具有高度异质性[1-3]。信号转导与转录激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)家族由STAT 1～6组成，其中STAT5包含STAT5A和STAT5B两种高度同源亚型[4]。STAT5主要以失活状态存在于细胞质中，在外界细胞因子等刺激作用下，STAT5第694位酪氨酸 (Tyrosine 694, Tyr694)(STAT5A)或699位酪氨酸(Tyrosine 699, Tyr699)(STAT5B)发生磷酸化，STAT5以二聚体和(或)四聚体的形式转位到细胞核，作为转录因子发挥作用[5-6]。据文献报道，STAT5A表达异常与多种肿瘤的发生、发展密切相关，包括前列腺癌、肺癌、胃癌[6]。目前，STAT5A在DLBCL中的表达及作用尚不清楚。本文采用免疫组化法检测STAT5及磷酸化STAT5ATyr694(pSTAT5AY694)在DLBCL中的表达，探讨STAT5A在DLBCL中的作用，为临床实验提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料收集2013年3月～2018年7月江苏省南通市肿瘤医院确诊的非特指型DLBCL患者106例，患者术前均未接受放、化疗。其中，男性48例，女性58例。患者年龄11～93岁，中位年龄64.5岁。结外累及0～1处76例，≥2处30例。按Hans分型，生发中心B细胞样(germinal center B-cell-like, GCB)24例，非生发中心B细胞样(non germinal center B-cell-like, non-GCB)82例。Ann Arbor分期：Ⅰ+Ⅱ期38例，Ⅲ+Ⅳ期68例。无B症状95例，有B症状11例。美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)体能状态(performances status, PS)评分<2分者16例，≥2分者90例。国际预后指数(international prognostic index, IPI)评分≤2分者33例，>2分者73例。无骨髓浸润75例，有骨髓浸润8例，另有23例无法评估。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)正常26例，升高80例(>211 U/L)。β2微球蛋白(β2-microglobulin, β2-MG)正常47例，升高15例(>4 mg/L)，另有44例无法评估。白蛋白(albumin, ALB)正常89例，降低17例(<35 g/L)。治疗后完全缓解(complete response, CR)/部分缓解(partial response, PR)71例，疾病稳定/进展35例。本实验经我院医学伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 免疫组化一抗STAT5(1 ∶100)购自Cell Signaling Technology公司(该抗体优先检测STAT5A，对STAT5B可能会有微弱反应)，pSTAT5AY694(1 ∶200)购自Abcam公司，二抗及DAB购自Dako公司。免疫组化采用EnVision法，具体操作步骤按试剂盒说明书进行，用已知阳性组织作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。STAT5定位于细胞质/细胞核，pSTAT5AY694定位于细胞核。参考Morichika等[7]的标准，将核阳性细胞百分比≥30%定义为STAT5核阳性、pSTAT5AY694阳性。

1.3 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。采用Pearson χ2检验或Fisher精确概率检验分析STAT5核表达及pSTAT5AY694表达水平与DLBCL临床病理特征的关系。利用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用单因素和多因素Cox进行预后分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 STAT5核表达以及pSTAT5AY694表达与DLBCL临床病理特征的相关性STAT5可定位于细胞质/细胞核(图1、2)，STAT5主要以失活状态存在于细胞质中，而活化的STAT5以二聚体和(或)四聚体的形式转位到细胞核，作为转录因子发挥功能。本组对STAT5核表达进行分析，106例DLBCL中STAT5核表达91例，不表达15例。STAT5核表达与骨髓浸润(P=0.004)、治疗反应(P=0.001)相关，其在有骨髓浸润、疾病进展/稳定患者中的表达高于无骨髓浸润、PR/CR患者。STAT5核表达与患者性别、年龄、结外累及、Hans分型、Ann Arbor分期、B症状、ECOG PS评分、IPI评分、Ki-67增殖指数、LDH水平、β2-MG水平、ALB水平均无关(P均>0.05，表1)。pSTAT5AY694定位于细胞核(图3、4)，pSTAT5AY694表达水平与Ki-67增殖指数(P=0.022)、治疗反应(P=0.003)相关，其在Ki-67增殖指数≥75%、疾病进展/稳定患者中的表达高于Ki-67增殖指数<75%、PR/CR患者。pSTAT5AY694表达水平与患者性别、年龄、结外累及、Hans分型、Ann Arbor分期、B症状、ECOG PS评分、IPI评分、骨髓浸润情况、LDH水平、β2-MG水平、ALB水平均无关(P>0.05，表1)。

表1 STAT5核表达、pSTAT5AY694表达水平及与弥漫大B细胞淋巴瘤临床病理特征的相关性

图1 弥漫大B细胞淋巴瘤中STAT5核阴性，EnVision法 图2 弥漫大B细胞淋巴瘤中STAT5核阳性，EnVision法 图3 弥漫大B细胞淋巴瘤中pSTAT5AY694阴性，EnVision法 图4 弥漫大B细胞淋巴瘤中pSTAT5AY694阳性，EnVision法

2.2 STAT5核表达、pSTAT5AY694表达与DLBCL预后的关系截至2021年5月10日，随访时间2～93个月，中位随访时间为37个月，死亡60例，其中STAT5核阴性组死亡48例，阳性组死亡12例；pSTAT5AY694阴性组死亡15例，阳性组死亡45例。Kaplan-Meier生存分析显示：STAT5核阳性组的总生存期(overall survival, OS)低于阴性组(P=0.011 7，图5A)；pSTAT5AY694阳性组的OS低于阴性组(P=0.010 2，图5B)。单因素Cox回归分析显示：年龄(P=0.006)、Hans分型(P=0.047)、B症状(P<0.001)、ECOG PS评分(P=0.008)、IPI评分(P<0.001)、骨髓浸润(P=0.008)、LDH水平(P=0.002)、ALB水平(P=0.002)、治疗反应(P<0.001)、STAT5核表达(P=0.016)、pSTAT5AY694表达(P=0.013)是患者预后的影响因素。将单因素分析有统计学意义的因素纳入多因素Cox回归分析，年龄、ECOG PS评分、LDH水平已包含于IPI评分，不再纳入多因素分析。多因素Cox回归分析显示：Hans分型(P=0.048)、IPI评分(P=0.018)、治疗反应(P=0.001)是患者独立的预后因素。STAT5 核表达(P=0.243)、pSTAT5AY694表达水平(P=0.093)是影响OS的相关因素，但不是预后的独立影响因素(表2)。

图5 A. 弥漫大B细胞淋巴瘤中STAT5核表达的Kaplan-Meier生存曲线；B.弥漫大B细胞淋巴瘤中pSTAT5AY694表达的Kaplan-Meier生存曲线

表2 弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后的单因素及多因素Cox分析

3 讨论

STAT5A是STAT转录因子家族成员之一。STAT家族高度保守，每个家族成员在700位附近都有1个酪氨酸残基，该残基可在细胞质中被JAK磷酸化[8-9]。STAT家族作为核转录因子，可激活多种基因的表达，包括一些参与肿瘤细胞发育、生长和存活的基因。当一个或多个上游酪氨酸激酶由于基因改变过度活化时，可引起某些STAT家族成员(如STAT3和STAT5)持续活化，进而导致多种实体肿瘤和血液恶性肿瘤的发生、发展[10]。STAT5最初被鉴定为催乳素活化的乳腺因子，随后针对白介素-3诱导的信号转导和克隆研究发现两种高度相关的亚型：STAT5A和STAT5B。STAT5A是乳腺中主要的STAT5亚型，而STAT5B是肝脏中主要的STAT5亚型。人类STAT5A和STAT5B位于染色体17q11.2，在氨基酸水平上有91%的同源性，不同之处主要在C末端。STAT5由N端结构域(N-terminal domain)、卷曲螺旋结构域(coiled-coil domain)、DNA结合结构域(DNA-binding domain)、Src同源2结构域(Src-homology 2 domain)以及C端反式激活结构域(C-terminal transactivation domain)等功能域组成[4]。STAT5信号通路受到短暂且严格的调控，可被多种细胞因子激活，如催乳素、生长激素、促红细胞生成素、血小板生成素。STAT5功能受翻译后修饰、细胞因子信号抑制物(suppressor of cytokine signaling, SOCS)家族成员、活化STAT抑制蛋白家族成员、磷酸酶和各种蛋白质-蛋白质相互作用的调节。STAT5分别通过STAT5A和STAT5B的694和699位酪氨酸磷酸化激活，并且可以通过去磷酸化进行负调节。酪氨酸磷酸化对于STAT5活性至关重要，其可被受体相关的JAK以及非受体Src激酶磷酸化[11]。

有研究报道，STAT5在造血细胞中广泛表达，多种细胞因子和生长因子可通过激活STAT5诱导造血。许多研究表明，STAT5异常活化在多种血液系统恶性肿瘤中起重要作用，如BCR-ABL阳性慢性粒细胞白血病、FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3, FLT3)突变的急性髓细胞白血病、JAK2V617F基因突变的骨髓增生性疾病[12]。在胃癌中分化型胚胎软骨发育基因2(differentiated embryonic chondrocyte-expressed gene 2, DEC2)可通过抑制STAT5A的激活增强5-氟尿嘧啶诱导的肿瘤细胞凋亡，并抑制肿瘤细胞增殖[13]。近期Li等[6]报道，STAT5A在阿霉素耐药乳腺癌细胞系及化疗耐药乳腺癌患者中表达水平较高；STAT5A可通过调节ABCB1的转录调节乳腺癌的化疗耐药性。本实验发现，在DLBCL中STAT5核表达与骨髓浸润(P=0.004)、治疗反应(P=0.001)相关，其在有骨髓浸润、疾病进展/稳定患者中的表达高于无骨髓浸润、PR/CR患者。pSTAT5AY694表达水平与Ki-67增殖指数(P=0.022)、治疗反应(P=0.003)相关，其在Ki-67增殖指数≥75%、疾病进展/稳定患者中的表达高于Ki-67增殖指数<75%、PR/CR患者。但STAT5核表达及pSTAT5AY694表达水平与其它临床病理特征均无关(P均>0.05)。Mirtti等[14]报道，在未经治疗的前列腺癌中STAT5核表达增加与前列腺癌的侵袭性相关，STAT5核表达有助于预测早期前列腺癌特异性死亡。本组发现DLBCL中，STAT5核阳性组的OS低于阴性组(P=0.011 7)；pSTAT5AY694阳性组的OS低于阴性组(P=0.010 2)。单因素和多因素Cox回归分析显示：STAT5 核表达(P=0.243)、pSTAT5AY694表达水平(P=0.093)是影响OS的相关因素，但不是预后的独立影响因素。

综上所述，本实验发现STAT5核表达以及pSTAT5AY694表达与DLBCL患者的治疗反应相关。STAT5核阳性、pSTAT5AY694阳性DLBCL患者的OS比阴性患者缩短；STAT5核表达、pSTAT5AY694表达水平是影响OS的相关因素，但不是预后的独立影响因素。