黄精养生饮增强免疫功能的实验研究

陈宇，武柳君，彭腾，熊秋韵，李梦婷，陈胡兰，谢晓芳▲，彭成▲

(1.成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137;2.西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137)

黄精养生饮是以中药黄精为原料制备的保健功能食品，由成都中医药大学黄精产业研究所研发，由黄精、山药等制备而成。黄精具有补气养阴、健脾、益肾等功效，主治脾胃气虚、体倦乏力、胃阴不足、内热消渴等[1]。山药具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精的功效，主治脾虚食少、久泻不止、肺虚喘咳等[1]。黄精、山药均是药食两用的补益类中药[2]，应用历史悠久，为传统养生保健佳品。研究表明，黄精、山药都含有大量多糖类成分[3-4]，多糖为大多补益类中药的主要活性成分，其恢复和促进机体免疫功能的作用已得到了现代科学研究的广泛证实[5-8]。由上推断以黄精、山药等为原料制成的黄精养生饮也可能具有调节免疫的功效。本研究采用正常小鼠和氢化可的松诱导的免疫低下模型小鼠进行试验[9-10]，通过检测特异性和非特异性免疫功能相关指标，评价黄精养生饮是否具有调节免疫功能的作用，为其进一步开发和应用提供理论依据。

1 实验材料与设备

1.1 实验动物

KM小鼠，SPF级，体质量(20±2)g，雌雄各半，购于成都达硕实验动物有限公司，生产许可证号SYXK(川)2015-30；豚鼠，购于成都达硕实验动物有限公司，生产许可证号SCXK(川)2015-030。实验涉及动物的饲养和实验过程中都遵守成都中医药大学实验动物管理与保护的有关规定。

1.2 实验药物和试剂

黄精养生饮，1 g生药/mL，由成都中医药大学黄精产业研究所彭腾研究员制备，用双蒸水配制成实验所需剂量，即5、2.5、1.25、0.625 g/kg；贞芪扶正胶囊(甘肃扶正药业科技股份有限公司，批号：J20170208)，取12粒胶囊相当于原生药25 g用双蒸水配制成5 g/kg；氢化可的松(天津金耀药业有限公司，批号：1811231)，临用前用生理盐水配制成40 mg/kg备用；墨汁；鸡红细胞悬液(自制)。

1.3 仪器

全波长多功能酶标仪(VARIOSKAN FLASH 2.4.3，美国Thermo公司)；电子分析天平(AL104，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；高速冷冻离心机(Allegra X-30R，美国Beckman)。

2 实验方法

2.1 正常小鼠碳粒廓清试验[11-12]

取小鼠60只随机分为6组：正常对照组(双蒸水)、贞芪扶正胶囊组(5 g/kg)、黄精养生饮4个剂量组(5、2.5、1.25、0.625 g/kg)，每组10只。首次给药前禁食不禁水12 h，各组小鼠分别灌胃给予相应的药物，称重并灌胃给药1次/d，连续给药28 d。于末次给药后禁食不禁水24 h，按0.1 mL/10 g尾静脉注射生理盐水稀释4倍的墨汁(v/v)，于注射后第2 min(t1)、10 min(t2)分别用经肝素钠预处理的毛细管于眼后静脉丛取血200 μL于盛有2 mL 0.1%碳酸钠溶液的EP管中，吸入、吹出数次，混合均匀后吸取100 μL于96孔板内，600 nm处测定并分别记录吸光度值OD1、OD2。麻醉后颈椎脱臼处死小鼠，解剖取脾脏、肝脏，称重并计算脏器指数。按下列公式计算脏器指数和吞噬指数α。

脏器指数(%)=脏器质量(g)/体质量(g)×100%

K=(LogOD1-LogOD2)/(t2-t1)

α=体质量/(肝质量+脾质量)×K1/3

2.2 氢化可的松致免疫功能低下试验[13]

2.2.1 血清溶血素的测定[14]

2.2.1.1 鸡红细胞悬液和补体的制备

鸡红细胞悬液制备：无菌操作，自鸡翼下静脉取血，置于100 mL疫苗瓶中，加 5 倍量Alsever液，摇匀，4℃冰箱储存。临用时，用生理盐水洗涤3次，前两次232×g离心5 min，弃上清液和界面的白细胞层，后连续两次412×g离心5 min，直至血细胞比容恒定，按此值用生理盐水配成 5% 鸡红细胞悬液。补体制备：3只豚鼠股动脉抽血，取血清并混合，用生理盐水稀释成10%补体备用。

2.2.1.2 血清溶血素测定

取小鼠70只随机分为七组：正常对照组、模型对照组、贞芪扶正胶囊组(5 g/kg)、黄精养生饮4个剂量组(5、2.5、1.25、0.625 g/kg)，每组10只。首次给药前禁食不禁水12 h，正常对照组和模型对照组给予双蒸水灌胃，其于各组分别给予相应药物，称重并灌胃1次/d，连续给药10 d。给药前30 min，正常对照组皮下注射生理盐水，其余各组均皮下注射氢化可的松40 mg/kg造模，2天一次，共5次。另给药第3天，各组小鼠0.2 mL/只腹腔注射5%鸡红细胞悬液。末次给药后禁食不禁水24 h，摘眼球取血0.5 mL后麻醉颈椎脱臼处死小鼠，取得的血1 860×g离心10 min，取血清20 μL，以0.9% NaCl稀释血清100倍(v/v)，取稀释血清1 mL与5%鸡红细胞悬液0.5 mL、10%补体0.5 mL混合，空白管用生理盐水代替血清，37℃恒温孵育30 min后，放于4℃冰箱终止反应；1 860×g离心10 min，取上清液300 μL于96孔板，540 nm处测定并分别记录吸光度值。

2.2.2 迟发性变态反应[15]

取小鼠70只随机分为七组：正常对照组、模型对照组、贞芪扶正胶囊组(5 g/kg)和黄精养生饮4个剂量组(5、2.5、1.25、0.625 g/kg)，每组10只。首次给药前禁食不禁水12 h，正常对照和模型对照组灌胃双蒸水，其余各组分别灌胃给予相应药物，称重并灌胃1次/d，连续10 d。给药前30 min，正常对照组皮下注射生理盐水，其余各组均皮下注射氢化可的松40 mg/kg造模，2天一次，共5次。于给药第4天，将50 μL 1%二硝基氯苯丙酮麻油溶液均匀涂于面积约为9 cm2的小鼠腹部(剃刀除毛)，第2天同剂量同部位再强化1次致敏。末次给药30 min后于小鼠右耳两面涂1%二硝基氯苯丙酮麻油溶液20 μL/只进行攻击，攻击24 h。麻醉后颈椎脱臼处死小鼠，用直径8 mm的打孔器于左右耳相同部位打下耳片，称重，并以左右耳片的质量差为肿胀度，比较各组小鼠的耳廓肿胀度。

2.3 数据统计分析

3 实验结果

3.1 黄精养生饮对正常小鼠免疫功能的影响

由表1可知，给予黄精养生饮后，各剂量组小鼠在体质量，肝脏、脾脏指数，吞噬指数α值上与正常对照组相比未见明显差异。表明黄精养生饮对正常小鼠的免疫功能无明显影响(见表1)。

表1 正常小鼠体质量、脏器指数、吞噬指数α

3.2 黄精养生饮对氢化可的松致小鼠免疫低下的影响

3.2.1 对血清溶血素的影响

与正常对照组相比，氢化可的松模型对照组小鼠血清溶血素水平降低(P<0.01)；与模型对照组相比，黄精养生饮各剂量组小鼠血清溶血素水平提高(P<0.01)，但在5 g/kg剂量下无统计学意义(见表2)。

表2 免疫低下小鼠血清溶血素水平

3.2.2 对迟发性变态反应的影响

由表3可知，与正常对照组相比，模型对照组小鼠的耳廓肿胀度明显降低(P<0.05)；与模型对照组相比，黄精养生饮各剂量组小鼠耳廓肿胀度均有回升趋势，但差异无统计学意义。

表3 免疫低下小鼠耳廓肿胀度

4 讨论

免疫系统主要由免疫器官、免疫细胞、免疫活性物质组成，包括中枢和外周免疫器官、淋巴细胞、单核吞噬细胞等[16]，发挥特异性免疫和非特异性免疫调节功能。免疫器官质量可衡量免疫抑制状态下机体免疫功能的强弱，其中胸腺、脾脏、肝脏是重要的免疫器官，是衡量免疫功能的重要指标[17]。单核巨噬细胞是非特异性免疫的重要组成部分，当细菌、异物等抗原性物质进入机体后，可迅速被其吞噬和清除，其吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一[18-19]。实验研究常用碳粒廓清法测定血液中碳粒的消失速度来反映单核巨噬细胞吞噬异物的能力[20]。本研究灌胃给予正常小鼠黄精养生饮，结果显示在5 g/kg剂量下小鼠的体质量、肝和脾的脏器指数及碳粒廓清吞噬指数有升高趋势，但无统计学意义，表明其对正常状态下的免疫系统没有严重影响，不会引发正常状态下机体免疫功能的异常亢进。

特异性免疫包括体液免疫和细胞免疫，是机体免疫防御的重要组成部分。血清溶血素的含量反映了B淋巴细胞增值及分化为浆细胞后分泌溶血素的能力，常用于评价机体的体液免疫功能[21]。本研究中，氢化可的松诱导的免疫抑制模型小鼠血清溶血素水平降低，各剂量黄精养生饮均可使血清溶血素水平回升，表明黄精养生饮可增强免疫低下状态下的体液免疫功能。迟发型变态反应常用于评价细胞免疫功能，采用致敏抗原激活T淋巴细胞形成活化T淋巴细胞，当活化T淋巴细胞再次与相应致敏抗原接触，两者发生特异性结合并释放出多种细胞因子，导致局部组织发生以单核细胞浸润和变性坏死为主要特征的炎症反应[22]。本研究发现，与模型对照组相比，黄精养生饮在一定程度上能增加小鼠的耳肿胀度，反映其对小鼠迟发型变态反应具有一定的刺激作用，表明黄精养生饮可增强免疫低下小鼠细胞免疫功能。

本实验初步探索了黄精养生饮对正常小鼠和免疫低下模型小鼠免疫功能的影响，结果显示其对正常小鼠的免疫功能有一定程度的增强趋势，但无统计学意义，而同剂量下可增强免疫低下小鼠的血清溶血素水平、提高T淋巴细胞活性，显示出提升体液免疫和细胞免疫的功能。给药期间，小鼠无其它不良反应或不适表现。研究表明，黄精养生饮作为一种增强免疫功能的功能饮品作用温和有效且安全。