郭嘉鑫,雷有庭,韩鸿萍,许立秀,陈 志*
(1.青海师范大学 生命科学学院,青海 西宁 810016; 2.青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室,青海 西宁 810016;3.青海省互助土族自治县林业和林草站,青海 海东 810600; 4.青海师范大学 化学化工学院,青海 西宁 810016)
暗紫贝母(FritillariaunibracteataHsiao et K.C.Hsia)隶属于百合科贝母属,多年生草本植物,其鳞茎呈球形或圆锥形,茎直立、无毛、绿色或深紫色;叶为条形或者条状披针形[1];花呈深紫色、单朵、被片上有黄褐色的小方格[2].主要分布于四川西部、青海南部以及甘肃南部2800m~4400m的高寒灌丛草地和高寒草甸地区[3].
贝母属中的主要化学成分可分为生物碱类及非生物碱类,生物碱主要为异甾体生物碱和甾体生物碱;非生物碱类成分主要含有有机酸及其酯类、皂苷类、核苷类、甾醇、多糖类、挥发油类等[4-5].其中萜类化合物在贝母属植物中分布最为广泛[6].
暗紫贝母以其干燥鳞茎入药,具有清热润肺、化痰止咳以及散结消肿的功效,具有良好的药用价值[7].其药理活性主要包括镇咳、祛痰[8]、平喘、抗炎[9]、抗菌[10]、降压、抗肿瘤[11]等.有研究显示,百合科植物挥发油对抗炎、抗菌及镇痛等方面有显著功效[12].
挥发油提取的传统手段通常是水蒸气蒸馏法,此法操作方便,设备简单,但使用此法提取过程会使得热敏性成分降解,品质降低,药理作用减弱[13-14],且提取时间长.超临界流体色谱(Supercritical Fluid Chromatography,SFC),在超临界状态下的流体具有气体的高扩散与低粘度,同时具有液体良好的溶解能力,因此可作为溶剂进行萃取[15].超临界CO2提取法提取时间短且高效,同时CO2能够保护热敏性、易氧化分解成分不被破坏,提高了所得挥发油的品质[16],得油率和抗氧化活性等也得到提高[17],能有效解决传统水蒸气蒸馏法的不足.大量研究表明,超临界CO2适用于挥发油的提取,并从中鉴定出萜类、酯类、醇类、烷烃类、烯烃类、酚类等多种化合物[18-19].
目前对于百合科中暗紫贝母挥发油的研究较少,本研究采用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)联用技术对超临界CO2萃取法制备的暗紫贝母挥发油成分进行分离鉴定,为暗紫贝母的开发利用提供依据.
暗紫贝母,2021年9月购自青海省果洛州班玛县药材批发市场,经青海师范大学生命科学学院马永贵教授鉴定为青海产暗紫贝母干燥鳞茎.
1.2.1 实验仪器
XT-250型高速多功能粉碎机,浙江永康红太阳机电厂;HA221-40-12型超临界CO2流体萃取装置,南通仪创实验有限公司;TSQ 8000 Evo型气相色谱-质谱联用仪,赛默飞世尔科技;天平(精度0.1mg),梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司.
1.2.2 实验试剂
无水乙醇,分析纯;环己烷,色谱纯;二氧化碳气体,纯度>99.9%,食品级.
1.3.1 超临界CO2萃取暗紫贝母挥发油
将暗紫贝母干燥鳞茎粉碎过40目筛,称取1.0kg暗紫贝母样品,通过超临界CO2萃取技术进行成分提取,条件为:萃取釜温度40℃、压力20MPa,分离器Ⅰ内温度50℃、压力6.5MPa,分离器Ⅱ内温度30℃、压力4MPa,二氧化碳流量80~100kg/h,每30min接一次样品,萃取2h,称重,计算提取率.
计算暗紫贝母挥发油提取率的公式如下式(1):
(1)
上式中:X为暗紫贝母挥发油提取率(%);m1为暗紫贝母原料质量(g);m2为暗紫贝母挥发油质量(g).
1.3.2 暗紫贝母挥发油GC-MS分析
取1mg暗紫贝母超临界挥发油,用1mL环己烷超声溶解,取10μL溶解后的挥发油用1mL环己烷稀释后供GC-MS分析.
气相色谱条件:载气为氦气,载气流速1mL/min,分流进样,分流比为50∶1,进样口温度280℃,进样量1μL;升温程序:60℃开始保持1min,10℃/min升至180℃,4℃/min升至280℃,保持20min,20℃/min升至300℃,保持2min.
质谱条件:离子源温度为250℃,传输线温度为285℃,质谱扫描范围为40-550,溶剂延迟时间为5min,电离能量为70eV.
经上述1.3.1中超临界CO2萃取条件得暗紫贝母挥发油,黄色膏状物,称重,计算提取率为2.2%.
经上述1.3.2中GC-MS条件分析后通过NIST谱库检索,以峰面积归一法计算暗紫贝母超临界挥发油中各组分相对百分含量,暗紫贝母超临界挥发油总离子流色谱图见图1,暗紫贝母超临界挥发油化学成分及其相对含量见表1.
由图1和表1可知,从暗紫贝母超临界CO2挥发油中,共分离得到39个组分,并鉴定出32个化合物,其中相对百分含量较高的有1-二十三醇(3.61%),七氟丁酸三十四烷基酯(3.59%)和反式-(2,3-二苯基环丙基)甲基苯基亚砜(3.24%)等.
图1 暗紫贝母CO2超临界挥发油的GC-MS总离子流图
表1 暗紫贝母挥发油化学成分
续表
2.2.1 暗紫贝母挥发油中酯类化合物
七氟丁酸三十四烷基酯、五氟丙酸三十八烷基酯、三氯乙酸棕榈基酯、七氟丁酸二十二、烷基酯、五氟丙酸三十四烷基酯、碳酸二十烷基乙烯基酯的二级质谱图及结构图依次为图2、图3、图4、图5、图6、图7.
图2 七氟丁酸三十四烷基酯的二级质谱图及结构图 图3 五氟丙酸三十八烷基酯的二级质谱图及结构图 图4 三氯乙酸棕榈基酯的二级质谱图及结构图
图5 七氟丁酸二十二烷基酯的二级质谱图及结构图 图6 五氟丙酸三十四烷基酯的二级质谱图及结构图 图7 碳酸二十烷基乙烯基酯的二级质谱图及结构图
2.2.2 暗紫贝母挥发油中醇类化合物
1-二十三醇、2-辛基-1-十二醇、2-辛基-1-癸醇、二十八醇、2-甲基-1-十六烷醇、二十二醇的二级质谱图及结构图依次为图8、图9、图10、图11、图12、图13.
图8 1-二十三醇的二级质谱图及结构图 图9 2-辛基-1-十二醇的二级质谱图及结构图 图10 2-辛基-1-癸醇的二级质谱图及结构图
图11 二十八醇的二级质谱图及结构图 图12 2-甲基-1-十六烷醇的二级质谱图及结构图 图13 二十二醇的二级质谱图及结构图
2.2.3 暗紫贝母挥发油中烷烃类化合物
1-环戊基-4-(3-环戊基丙基)十二烷、1,3-二苯基丙烷、二十一烷、四十四烷、[6-环戊基-3(3-环戊基丙基)乙基]环己烷、二十八烷的二级质谱图及结构图依次为图14、图15、图16、图17、图18、图19.
图14 1-环戊基-4-(3-环戊基丙基)十二烷的二级质谱图及结构图 图15 13-二苯基丙烷的二级质谱图及结构图 图16 二十一烷的二级质谱图及结构图
图17 四十四烷的二级质谱图及结构图 图18 [6-环戊基-3(3-环戊基丙基)乙基]环己烷的二级质谱图及结构图 图19 二十八烷的二级质谱图及结构图
2.2.4 暗紫贝母挥发油中烯烃类化合物
1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23-环二十四碳十二烯、1-二十九烯、1-二十七烯、1-二十二烯、(Z)-三十五碳-17-烯的二级质谱图及结构图依次为图20、图21、图22、图23、图24.
图20 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21,23-环二十四碳十二烯的二级质谱图及结构图 图21 1-二十九烯的二级质谱图及结构图 图22 1-二十七烯的二级质谱图及结构图
图23 1-二十二烯的二级质谱图及结构图图24 (Z)-三十五碳-17-烯的二级质谱图及结构图
2.2.5 暗紫贝母挥发油中芳香烃类化合物
1,3,5-三苯基苯、1,2,4-三苯基苯、[3-(2-环己基乙基)-6-环戊基己基]苯的二级质谱图及结构图依次为图25、图26、图27.
图25 1,3,5-三苯基苯的二级质谱图及结构图图26 1,2,4-三苯基苯的二级质谱图及结构图图27 [3-(2-环己基乙基)-6-环戊基己基]苯的二级质谱图及结构图
2.2.6 暗紫贝母挥发油中其他化合物
反式-(2,3-二苯基环丙基)甲基苯基亚砜、十四烷基环氧乙烷、1,54-二溴五十四烷、叔十六硫醇、2-[(乙酰基[2-羰基-1-吡咯烷基)甲基]氨基]-丁酸、3-乙酰氧基-7,8-环氧烷-11-醇的二级质谱图及结构图依次为图28、图29、图30、图31、图32、图33.
图28 反式-(2,3-二苯基环丙基)甲基苯基亚砜的二级质谱图及结构图图29 十四烷基环氧乙烷的二级质谱图及结构图
图30 1,54-二溴五十四烷的二级质谱图及结构图
图31 叔十六硫醇的二级质谱图及结构图 图32 2-[(乙酰基[2-羰基-1-吡咯烷基)甲基]氨基]-丁酸的二级质谱图及结构图 图33 3-乙酰氧基-7,8-环氧烷-11-醇的二级质谱图及结构图
药用植物挥发油活性成分包括萜类、酚类、醇类、醛类、酮类等化合物,均具有广谱的抗菌活性[20-21].汪莹[22]等人研究发现乳香挥发油中可能通过MAPK1、CNR1和CXCL8等潜在靶点,调节神经活动配体-受体相互作用通路、氮代谢通路和癌症通路等相关信号通路达到镇痛的作用.齐富有[23]等通过对白苏叶超临界CO2所得挥发油的研究发现,其要成分为酯类、醇类和烯类化合物,具有较强的抗氧化能力.此外挥发油还具有体外降血糖活性[24]以及抗关节炎活性[25].冯青[26]等研究了吊兰、一叶兰和文竹三种百合科植物的挥发油成分,发现其都含有萜类化合物、醇类化合物、醛类化合物、酯类化合物.杜伟锋[27]等通过水蒸气蒸馏法从鲜切浙贝母中提取挥发油,通过GC-MS分析鉴定挥发油中含有酯类化合物、醇类化合物与烯烃类化合物.梁君玲[28]等通过水蒸气蒸馏法从浙贝母花中提取挥发油,通过GC-MS鉴定出38种挥发性成分,其中包括酯类化合物、烯烃类化合物、醇类化合物以及芳香醛酮类化合物等.
本研究从暗紫贝母超临界CO2挥发油共分离得到39个组分,并鉴定出32个化合物,其中酯类化合物占总色谱流出峰26%,醇类化合物占21%,烷烃类化合物占20%,烯烃类化合物占9%,芳香烃类化合物占9%,还有其他化合物占15%.此结论与杜伟锋、梁君玲等对浙贝母挥发油成分的分析相吻合.对于挥发油成分的提取,超临界CO2更加高效快捷,适合提取暗紫贝母中酯类、醇类、烃类等成分.因此,超临界CO2提取暗紫贝母中挥发油是一种有效的、值得推广的方法.