彭芳辰,郑 斌,王 晶,张 慧,陈丽芳,郝 杰,雷 崐,康 静(.山西省人民医院药学部临床药学科,太原 000; .山西省人民医院皮肤科,太原 000; .山西省人民医院内分泌科,太原 000; .山西省人民医院中医科,太原 000)
复方肤参霜源于临床验方,该方由苦参、地肤子和丁香等9味中药组成,在临床上以外洗和外浴的方法应用于皮肤瘙痒症患者,具有良好的安全性和止痒效果,深受患者喜爱,但缺点为使用不便。本研究对9味中药经水提、醇提和浓缩等工艺制备,利用现代透皮吸收技术制成霜剂,具有清热祛风止痒、滋阴养血润肤的功效,兼具抗炎、抗过敏的作用;同时具有使用简便、携带方便和易于存放的优点。前期研究完成了苦参中所含苦参碱和氧化苦参碱的含量测定,以及地肤子和丁香的定性鉴别,有效控制了该制剂的质量。为了更好地评价复方肤参霜的安全性和药效,本研究进行了抗炎、止痒等药效学动物实验,并通过急性毒性试验评价其安全性,以期为其临床应用的有效性及安全性评价提供实验基础。
清洁级昆明种(KM)小鼠[合格证号:SCXK(晋)2019-0001],20~30 g,雌雄各半,由我院动物实验中心提供。豚鼠[合格证号:SCXK(晋)2019-0002],280~320 g,雌雄各半,由山西省太原市康宝瑞实验动物技术有限公司提供。健康成年新西兰白兔[合格证号:SCXK(京)2016-0007],2~2.5 kg,雌雄各半,由中国食品药品鉴定所提供。动物(小鼠)实验环境为我院动物实验中心SPF级动物实验室[设施使用许可证号:SYXK(晋)2019-0003];动物(豚鼠)实验环境为中国辐射防护研究院SPF级动物实验室[设施使用许可证号:SYXK(晋)2018-0005];动物(新西兰白兔)实验环境为山西省医药与生命科学研究院SPF级动物实验室[设施使用许可证号:SYXK(晋)2017-0001]。本实验遵守国家有关实验动物保护和使用准则,经我院伦理委员会(伦理批准号:2020省医科伦审字第141号)和中国辐射防护研究院实验动物管理和使用伦理委员会批准[伦理批准号:CRIP-IACUC-(R)-2019011]。
EK3820型动物电子秤(广东香山衡器集团股份有限公司);BSA2245-CW型电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司];BX41-32H02型生物显微镜(日本奥林巴斯公司)。
复方肤参霜(我院自制,研制批号:20190531);复方醋酸地塞米松乳膏(阳性对照药,华润三九医药股份有限公司,批号为1903023X)。硫化钠(天津市光复精细化工研究所,分析纯,批号:20181129);二甲苯(上海凌峰化学试剂有限公司,分析纯,批号:20170705);磷酸组胺(国药集团化学试剂有限公司,分析纯,批号:20150508);水为蒸馏水。
参照文献[1],取KM小鼠50只,随机分为低、中和高剂量复方肤参霜组,阳性对照组和空白对照组;分别在各组小鼠右耳耳廓均匀涂抹对应药物,即复方肤参霜0.5、1.0和2.0 g/kg,阳性对照药物(复方醋酸地塞米松乳膏)1.0 g/kg,空白基质1.0 g/kg,1日2次,连续3 d,第4日涂药1 h后对各小鼠右耳涂予二甲苯50 μL致炎,4 h后以纯化水洗去小鼠右耳药液,用棉球擦干后断颈处死小鼠,沿耳廓基线剪下双耳,用直径为8 mm的打孔器于双耳同部位打下圆耳片,分别称重。以左耳作为对照,左右耳片质量之差为肿胀程度,计算肿胀抑制率,肿胀抑制率(%)=(空白对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/空白对照组平均肿胀度×100%。
取豚鼠50只,随机分为低、中和高剂量复方肤参霜组,阳性对照组和空白对照组。实验前1 d,各豚鼠右后足剃毛;各组豚鼠右后足分别涂抹对应药物1次,即复方肤参霜0.5、1.0和2.0 g/kg,阳性对照药物(复方醋酸地塞米松乳膏)1.0 g/kg,空白基质1.0 g/kg。实验当日用粗砂纸擦伤豚鼠右后足剃毛处(面积约1 cm×1 cm),以少量渗血为度,按照前述方法对各组豚鼠涂抹对应药物1次,30 min后在创面处滴0.02%磷酸组胺0.05 mL/只,每次间隔3 min,至出现豚鼠舔该侧后足为止,累计各组每只豚鼠所用磷酸组胺总量(μg)为致痒阈。
参照相关文献[2],找出引起小鼠100%和0死亡的剂量。取12只KM小鼠,随机分为3组,每组4只,雌雄各2只,按0.02、0.01和0.005 mL/g的剂量,灌胃给予复方肤参霜。灌胃前12 h禁食、不禁水,灌胃后常规饲养,并观察小鼠3 d内死亡情况。
取KM小鼠60只,随机分为对照组、空白基质组(0.02 mL/g)和复方肤参霜组(0.02 mL/g),每组20只,雌雄各10只。按上述剂量灌胃给药1次,对照组小鼠按0.02 mL/g灌蒸馏水,灌胃前禁食12 h,不禁水,灌胃后常规饲养。连续观察14 d内动物的中毒反应及有无死亡,以死亡为主要指标,如无死亡,则以该用药量为小鼠的最大给药量。实验结束时称量小鼠的体重,计算灌胃给药组小鼠的最大给药量为拟临床用药剂量的倍数。
取KM小鼠40只,随机分为基质组和复方肤参霜组,每组20只,雌性各半;小鼠背部正中剪毛(约2.5 cm×4 cm),8%硫化钠溶液脱毛,24 h后在小鼠背部脱毛区分别涂抹空白基质和复方肤参霜(0.25 g/只),连续观察7 d,记录小鼠死亡数及毒性反应。
取新西兰兔8只,雌雄各半,随机分为完整皮肤组和破损皮肤组,每组4只,采用自身对照,所有新西兰兔背部脊柱两侧用剪刀去毛(每侧约3 cm×5 cm,无红斑、水肿及破损),再用8%硫化钠水溶液脱毛。破损皮肤组兔用消毒针头去毛区划“#”字以渗血为度。各组在左侧去毛区分别涂抹复方肤参霜(0.5、1.0 g),在右侧去毛区分别涂抹空白基质(1.0 g)和空白(不涂抹),用一层4 cm×6 cm保鲜膜覆盖保湿,加纱布覆盖保护,最后用无刺激性胶布和绷带适当固定。6 h后用温水洗去残留的受试药,于去除涂抹物后1、24、48和72 h观察涂抹部位有无红斑和水肿等情况,以及上述变化的恢复情况和时间,并对红斑水肿情况进行评分。
按“2.7”项下方法将新西兰兔处置去毛区,随机分为完整皮肤组和破损皮肤组。各组在左侧去毛区分别涂抹复方肤参霜(0.5、1.0 g),在右侧去毛区分别涂抹空白基质(1.0 g)和空白(不涂抹),按“2.7”项下方法对涂抹部位进行保湿、保护和固定。每日同一时间在同一部位涂抹药物1次,涂抹后6 h以温水洗去残留涂抹物,连续7 d。于每次去除涂抹物后1 h,再次涂抹前,末次给药后去除受试物后1、24、48和72 h,观察并记录涂抹部位红斑水肿及是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙或皮肤菲薄等情况发生及其消退时间,并对红斑水肿情况进行评分。
与空白对照组比较,阳性对照组和低、中和高剂量复方肤参霜组小鼠耳廓肿胀度均降低,差异有统计学意义(P分别为0.001、0.046、0.043和0.001);高剂量复方肤参霜组与阳性对照组小鼠耳廓肿胀程度相当,差异无统计学意义(P=0.901),见表1。提示复方肤参霜能够明显抑制二甲苯致小鼠耳廓炎症,且随剂量增加效果更显著,高剂量复方肤参霜可与对照药物等效。
表1 复方肤参霜对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响Tab 1 Effects of compound Fushen cream on xylene-induced auricular swelling in mice n=10)
与空白对照组比较,阳性对照组和低、中和高剂量复方肤参霜组豚鼠磷酸组胺所致的致痒阈均提高,差异有统计学意义(P分别为0.000、0.037、0.000和0.000);高剂量复方肤参霜组与阳性对照组豚鼠磷酸组胺所致的致痒阈相当,差异无统计学意义(P=0.320),见表2。提示复方肤参霜可以显著提高磷酸组胺对豚鼠的致痒阈,且随剂量增加效果更明显,高剂量复方肤参霜可与对照药物等效。
表2 复方肤参霜对磷酸组胺致豚鼠足趾致痒阈的影响Tab 2 Effects of CFC on the itching threshold of guinea pig toes induced by histamine
急性毒性试验预试验结果显示,三组小鼠均无死亡,无法测出其半数致死量(LD50),因此采用测定小鼠最大给药量来评估受试药物对小鼠的急性毒性作用。
空白基质组、复方肤参霜组和空白对照组,按0.02 mL/g一次灌胃给药后常规饲养,连续观察14 d,小鼠均无中毒反应及死亡。灌胃复方肤参霜后30 min内部分小鼠活动偶有减少,至1 h后完全恢复,实验期间给药动物无1只死亡,观察期间小鼠整体体重平稳增长,饮食、皮肤与毛发、行为、活动、分泌物(口、鼻、耳和眼)和排泄物(大小便)等均未见明显异常。实验结束后,处死全部小鼠,大体解剖、尸检,肉眼观察,各鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、胃和肠等主要脏器未见出血、充血、水肿、渗出、溃疡和穿孔,胸腔、腹腔、心包腔无积液。表明复方肤参霜灌胃给药对小鼠无明显急性毒性,其对小鼠灌胃的最大给药量为20 mL/kg或20.0 g/kg。实验7、14 d(实验结束时)称量小鼠的体重,结果见表3。在本实验条件下,KM小鼠口服给药复方肤参霜组不能求得LD50,其最大给药量为20.0 g/kg,该剂量约为人临床拟用剂量(0.05 g/kg)的400倍。
表3 口服给药急性毒性试验对小鼠体重的影响Tab 3 Effect of acute toxicity test of oral administration on body weight of mice n=10)
基质组和复方肤参霜组小鼠在皮肤给药60 min内,部分小鼠活动偶有减少,出现感觉不适症状(舔、用后肢挠痒背部涂药处),至2 h后完全恢复;实验期间给药动物无死亡;观察期间,小鼠饮食、行为和活动等均未见明显异常;口、鼻、耳和眼无异常分泌物,排泄物等均正常。用药处皮肤未见有红肿、渗出及溃烂等异常改变。实验7 d时,脱毛处皮肤毛发已经全部长出,皮肤光滑平整,复方肤参霜组与基质组未见明显差异。实验结束后,处死全部小鼠,大体解剖、尸检,肉眼观察各鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、胃和肠等主要脏器未见异常,胸腔、腹腔、心包腔无积液。小鼠体重稳步增长,实验7 d时基质组与复方肤参霜组小鼠体重比较,差异无统计学意义(P=0.977>0.05),见表4。
表4 复方肤参霜皮肤给药后对小鼠体重的影响Tab 4 Effect of compound Fushen cream for cutaneous administration on body weight of mice n=10)
完整皮肤组和破损皮肤组新西兰兔在涂药后1、24、48和72 h均存活,其饮食、行为活动、眼和黏膜、呼吸和精神状态、粪便和分泌物均正常,皮肤无红斑、水肿等现象,刺激反应均为0分。
完整皮肤组和破损皮肤组新西兰兔在用药的7 d及停药1、24、48和72 h后均存活,其饮食、行为活动、眼和黏膜、呼吸和精神状态、粪便和分泌物均正常,受药部位皮肤无色素沉着、出血点、皮肤粗糙和皮肤菲薄等情况,刺激反应均为0分,破损皮肤组破损部位已结痂脱落。病理组织学改变:可见各组皮肤结构正常,层次清晰,皮肤表皮、真皮、皮下及毛囊附属器均未见异常,受损皮肤炎症细胞较完整皮肤增多,100倍显微镜下观察的病理改变见图1—2。
A.兔背部完整皮肤病理表现;B.多次涂基质后的皮肤病理改变;C.兔背部皮肤涂多次1 g药膏后病理改变A.pathological features of intact skin of New Zealand rabbits; B.pathological changes of intact skin of New Zealand rabbits after repeated application of substrate; C.pathological changes of intact skin of New Zealand rabbits after repeated application of 1 g ointment图1 新西兰兔完整皮肤、多次涂基质及药膏后皮肤病理改变(HE染色,×100)Fig 1 Pathological features of intact skin, pathological changes of intact skin rabbits after repeated application of substrate and ointment of New Zealand (HE staining,×100)
A.兔背部受损皮肤病理表现;B.多次涂基质后的皮肤病理改变;C.兔背部皮肤涂多次1 g药膏后病理改变A.pathological features of damaged skin of New Zealand rabbits; B.pathological changes of damaged skin of New Zealand rabbits after repeated application of substrate; C.pathological changes of damaged skin of New Zealand rabbits after repeated application of 1 g ointment图2 新西兰兔受损皮肤、多次涂基质及药膏后皮肤病理改变(HE染色,×100)Fig 2 Pathological features of damaged skin, pathological changes of damaged skin after repeated application of substrate and ointment of New Zealand rabbits (HE staining,×100)
复方肤参霜方中以苦参为君药,其活性成分为苦参碱和氧化苦参碱,具有抗炎、抗病毒、抗菌、免疫调节和抗变态反应的作用[3-6];以地肤子为臣药,皂苷为其活性成分,具有止痒、抗菌、抗炎和抗变态反应的作用[7-9];以丁香为臣药,丁香油和丁香酚为其活性成分,具有抗菌、抗氧化和镇痛的作用[10]。9味药材配伍,共奏清热除湿、祛风止痒的效果;并且可以避免长期外用糖皮质激素类药物可能出现的局部皮肤萎缩变薄、毛细血管扩张、色素沉着和继发感染等不良反应[11]。
本研究以二甲苯诱发小鼠耳肿胀,模拟机体急性炎症的病理状态,以评价药物的抗炎作用,结果表明,低、中和高剂量复方肤参霜组小鼠的耳廓肿胀度较对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05);随着复方肤参霜剂量增加,小鼠耳廓肿胀度降低,差异有统计学意义(P=0.003)。说明二甲苯致小鼠耳廓炎症可被复方肤参霜显著抑制,且随剂量增加效果更显著。本研究利用磷酸组胺建立豚鼠瘙痒模型[12-14]。结果表明,与对照组比较,阳性对照组和低、中和高剂量复方肤参霜组豚鼠磷酸组胺所致的致痒阈均提高,且差异有统计学意义(P<0.05)。说明复方肤参霜可显著提高磷酸组胺对豚鼠的致痒阈,且随剂量增加效果更明显。皮肤给药的急性毒性试验中未发生小鼠死亡情况,体重稳步增长。说明皮肤给药途径下,复方肤参霜在相应最大给药量剂量范围内的安全性良好。实验新西兰兔饮食、行为活动、眼和黏膜、呼吸和精神状态、粪便和分泌物均正常,皮肤无红斑、水肿等现象,刺激反应均为0分,病理组织学切片可见各组皮肤结构正常,层次清晰,皮肤表皮、真皮、皮下及毛囊附属器均未见异常。
苦参碱注射液可以有效稳定肥大细胞膜,减少肥大细胞脱颗粒及降低组胺释放量[15]。本研究中发现,复方肤参霜能够显著提高动物的致痒阈值,与余明莲等[16]的研究结果一致。有研究结果证实,苦参碱能显著抑制炎症介质LTC4及LTB4的生物合成[17],能够降低大鼠TNF-α、IL-6水平[18],这些可能都是苦参碱产生抗炎作用的机制。
综上所述,复方肤参霜具有较明显的抗炎、止痒疗效,且安全性良好。本研究通过改变剂型,为临床提供了一种安全、方便、高效、质量可控的止痒、抗炎、抗过敏新制剂[19]。