恩诺沙星对西伯利亚鲟血清和肝脏中转氨酶活性的影响

刘 盼，杨 慕，贾成霞，张清靖，曲疆奇

( 北京市水产科学研究所 渔业生物技术北京市重点实验室，农业农村部北方地区渔业资源环境观测试验站，北京 100068 )

恩诺沙星又名乙基环丙沙星，是人工合成的第三代喹诺酮类药物，该药物具有高效广谱、副作用小以及不易产生耐药性等特点，已被应用于动物和人类多种感染性疾病的治疗，对水产动物的细菌感染性疾病也具有很好的疗效[1-4]。临床上，恩诺沙星被广泛应用于淡水鱼类疾病中的出血性败血症、烂鳃病、肠炎病、赤皮病等，同时也已被应用于鲟鱼养殖业中[5-7]。恩诺沙星在不同种类动物体内均可不同程度地代谢成环丙沙星，环丙沙星容易导致细菌产生耐药性，且易残留在动物体的血液和肝脏等组织中，对人类健康造成威胁，为保证动物源性食品的安全性，应对其进行药残监测[8]。谷草转氨酶和谷丙转氨酶是广泛存在于鱼类细胞浆和线粒体中的重要氨基酸转氨酶，在鱼类蛋白质代谢中起到非常重要的作用，其活性大小不仅反映氨基酸代谢程度的强弱，也是指示肝细胞功能的敏感指标[9-12]。陈琛等[6]研究了恩诺沙星对史氏鲟(Acipenserschrencki)和小体鲟(A.ruthenus)体内谷胱甘肽-S-转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶系活性的影响，结果表明，两种鲟鱼肝脏组织中谷胱甘肽-S-转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶系的变化幅度明显大于血浆中。艾晓辉等[13]研究了不同水温下磺胺甲恶唑在草鱼(Ctenopharyngodonidella)体内的药动力，结果表明，水温越高，草鱼体内的药物代谢越快。但西伯利亚鲟(A.baeri)在不同水温下恩诺沙星对其机体中转氨酶的影响还未见报道。笔者选择西伯利亚鲟最适生长水温中的较低温度(15 ℃)和较高温度(26 ℃)，研究在这两种水温条件下口灌恩诺沙星，实验室暂养的西伯利亚鲟体内的谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性的变化，进而得出温度对恩诺沙星代谢规律的影响，以期对水产养殖实践中不同水温下合理应用恩诺沙星给药方式、制定休药期及药物残留标准限量提供基础性的数据。

1 材料与方法

1.1 试验鱼及养殖

试验鱼为人工繁殖的西伯利亚鲟，取自北京市水产科学研究所房山养殖基地。挑选健壮无病无伤的西伯利亚鲟300尾。保证鱼的状态正常，无畸形；体色和皮肤光泽度正常，皮肤紧致无损伤，无病灶；眼球饱满，角膜清晰。体质量(212.3±5.6) g，体长(21.16±0.14) cm。试验前于养殖槽中暂养7 d，每日上、下午按体质量1%投喂鲟鱼专用不含任何药物的商品膨化饲料。试验用水为经活性炭过滤、充氧后经过曝气的自来水。养殖和暴露期间条件控制：水温由冷暖机自动控制(海鲜养殖恒温机，HYH-2DR-B，15 ℃和26 ℃)，水硬度8.0 mg/L，pH 7.6±0.3，溶解氧(8.60±1.04) mg/L。试验用西伯利亚鲟经抽查，组织中不含恩诺沙星。

1.2 试验方法

1.2.1 药品及试剂配置

恩诺沙星储备液的配制：恩诺沙星标准品0.1 g，使用流动相[V(乙腈)∶V(磷酸四丁基溴化铵)=5∶95]溶解，定容至500 mL，放入棕色瓶中4 ℃保存。该储备液质量浓度为200 μg/mL。

口灌恩诺沙星工作液的配制：取0.5 mL恩诺沙星储备液，加入流动相9.5 mL，配制成质量浓度为10.00 μg/mL的标准工作液。

1.2.2 给药及样品采集

在试验水温15 ℃和26 ℃下，从90尾西伯利亚鲟中随机选取5尾为1组，每个时间点取1组鱼，共18个取样时间点，另取10尾未口灌恩诺沙星的西伯利亚鲟作空白对照。试验在实验室带有循环系统的玻璃缸中进行。用套有橡皮软管的卡介苗注射器以10 mg/kg[14]给药剂量口灌恩诺沙星溶液，直立停留几秒，无回吐者保留试验。给药前12 h禁食，并于给药后0(空白对照)、0.125、0.25、0.5、1.0、1.5、2、4、6、8、12、18、24、36、48、60、72、96 h和120 h分别采取血液和肝脏样品，采集的血液于3 mL肝素抗凝管中，混匀，4000 r/min(离心半径1 cm)下离心15 min，分离血浆，-80 ℃保存待测。肝脏取出后剪碎，按1∶9 (m/V)加入预冷生理盐水(含0.75%氯化钠和0.03%氯化钾)，用手持式匀浆机于冰浴中制成匀浆液(10 000 r/min，4 ℃，3 min)。匀浆液经10 000 r/min(离心半径1 cm)离心10 min，取上清液备用。

1.3 酶活性测定

谷草转氨酶、谷丙转氨酶酶活性测定按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书操作。组织蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定。

1.4 数据处理

试验数据采用Excel 2010及SPSS 20.0软件进行统计分析，试验结果以平均值±标准差(n=5)表示，各组样本之间采用单因素方差分析和Duncan′s多重比较检验均值的差异显著性，以P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 不同温度下恩诺沙星对西伯利亚鲟血清和肝脏中谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性的影响

2.1.1 不同温度下恩诺沙星对西伯利亚鲟血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性的影响

不同温度下，恩诺沙星对西伯利亚鲟血清中谷草转氨酶活性的影响见图1。两温度组中，血清中的谷草转氨酶活性均被缓慢诱导至峰值。其中15 ℃试验组谷草转氨酶活性振荡较剧烈。谷草转氨酶活性最大值出现在给药后的24 h [(199.73±6.06) U/mg]，与对照组[(71.24±2.36) U/mg]差异显著(P<0.05)，但与其之后36～72 h几个时间点无显著性差异(P>0.05)。而在26 ℃试验组中，血清谷草转氨酶活性在36 h [(236.02±10.29) U/mg]出现峰值，与对照组[(38.86±2.98) U/mg]差异显著(P<0.05)，后缓慢下降至平稳。

图1 不同温度口灌恩诺沙星后西伯利亚鲟血清谷草转氨酶活性Fig.1 Glutamic-oxaloacetic transaminase activity in serum of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at different temperatures

不同温度下口灌恩诺沙星，血清中谷丙转氨酶活性随时间变化见图2。谷丙转氨酶活性均呈现逐渐升高至一定水平后趋于平稳的变化趋势。两温度组中，血清谷丙转氨酶活性均在6 h达到最高。其中15 ℃峰值为(66.73±3.71) U/g，与对照组[(18.15±1.27) U/mg]差异显著(P<0.05)；26 ℃试验组中，血清中谷丙转氨酶活性峰值为(286.93±24.50) U/mg，也与对照组[(7.36±1.04) U/mg]呈显著性差异(P<0.05)。在15 ℃试验组中，谷丙转氨酶活性在6 h达到最大值后逐渐下降，至18 h [(42.14±5.29) U/mg]后又缓慢上升，从24 h [(53.98±3.67) U/mg]后数值逐渐稳定，各时间点差异不显著(P>0.05)。在26 ℃试验组中，血清中谷丙转氨酶活性由1 h[(145.65±10.04) U/mg]时间点开始逐步上升至峰值后缓慢下降，在这段时间内各时间点差异不显著(P>0.05)。由其变化趋势可见，高温血清试验组中谷丙转氨酶更易被诱导且酶活性水平更高。

图2 不同温度口灌恩诺沙星后西伯利亚鲟血清谷丙转氨酶活性Fig.2 Glutamic-pyruvic transaminase activity in serum of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at different temperatures

2.1.2 不同温度下恩诺沙星对西伯利亚鲟肝脏中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性的影响

不同温度下，恩诺沙星对西伯利亚鲟肝脏中谷草转氨酶活性的影响见图3。两温度组中，肝脏中的谷草转氨酶活性均被明显诱导至一定数值后趋于稳定。15 ℃试验组肝脏谷草转氨酶活性最大值出现在给药后的0.5 h [(158.10±14.25) U/mg]，与对照组[(81.33±2.36) U/mg]差异显著(P<0.05)，但与其之后各组差异不显著(P>0.05)。而26 ℃试验组中，肝脏谷草转氨酶活性则在2 h[(182.79±18.90) U/mg]出现峰值，与对照组[(18.26±1.24) U/mg]差异显著(P<0.05)，后缓慢下降并趋于平稳，与后面各时间段差异不显著(P>0.05)。

图3 不同温度口灌恩诺沙星后西柏利亚鲟肝脏谷草转氨酶活性Fig.3 Glutamic-oxaloacetic transaminase activity in liver of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at different temperatures

不同温度下口灌恩诺沙星，肝脏中谷丙转氨酶活性测定见图4，谷丙转氨酶活性均呈现逐渐升高至一定水平后趋于平稳的变化趋势。不同温度下，15 ℃试验组中肝脏谷丙转氨酶活性在短时间内被显著诱导，在1.5 h时即达到活性峰值[(134.29±3.98) U/mg]，与对照组[(17.352±1.53) U/mg]差异显著(P<0.05)，随后逐渐趋于平稳。26 ℃试验组中，肝脏在36 h达到最大值[(129.40±16.00) U/mg]，与对照组[(60.13±2.325) U/mg]差异显著(P<0.05)，但与其后的各时间段差异不显著(P>0.05)。由其变化趋势可见，两个温度下，肝脏组织中谷丙转氨酶更易被诱导且酶活性水平更高。

图4 不同温度口灌恩诺沙星后西伯利亚鲟肝脏谷丙转氨酶活性Fig.4 Glutamic-pyruvic transaminase activity in liver of Siberian sturgeon orally administrated with of enrofloxacin at different temperatures

2.2 恩诺沙星对西伯利亚鲟血清和肝脏中谷草转氨酶、谷丙转氨酶的影响

2.2.1 15 ℃下恩诺沙星对西伯利亚鲟血清和肝脏中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性的影响

15 ℃下恩诺沙星对西伯利亚鲟血清和肝脏中谷草转氨酶活性影响见图5。由图5可见，口灌恩诺沙星0～4 h(除0.25 h外)，鱼体血清和肝脏中谷草转氨酶活性差异不显著(P>0.05)，而6～24 h时，血清中的谷草转氨酶活性显著高于肝脏中谷草转氨酶活性(P<0.05)，但36～120 h(除72 h外)，肝脏中谷草转氨酶活性又显著高于血清中谷草转氨酶活性(P<0.05)。

图5 15 ℃下口灌恩诺沙星后西伯利亚鲟血清和肝脏中谷草转氨酶活性Fig.5 The activity of glutamic-oxaloacetic transaminase in serum and liver of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at 15 ℃

15 ℃下恩诺沙星对西伯利亚鲟血清和肝脏中谷丙转氨酶活性影响见图6。与谷草转氨酶不同，对比0.25～4 h、36～120 h两个时间段，肝脏内谷丙转氨酶活性显著高于血清中谷丙转氨酶活性(P<0.05)，而试验中6～24 h时间段内，血清和肝脏中谷丙转氨酶活性差异不显著(P>0.05)。

图6 15 ℃下口灌恩诺沙星后西伯利亚鲟血清和肝脏中谷丙转氨酶活性Fig.6 The activity of glutamic-pyruvic transaminase in serum and liver of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at 15 ℃

2.2.2 26 ℃下恩诺沙星对西伯利亚鲟血清和肝脏中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性的影响

26 ℃下恩诺沙星对西伯利亚鲟血清和肝脏中谷草转氨酶的影响见图7。0～0.5 h，西伯利亚鲟血清中谷草转氨酶活性比肝脏中谷草转氨酶活性略高，但差异不显著(P>0.05)；1～4 h，肝脏中谷草转氨酶活性又略高于血清中谷草转氨酶活性，差异也不显著(P>0.05)；6～120 h，西伯利亚鲟血清中谷草转氨酶活性均高于肝脏中谷草转氨酶活性，其中在18、24、36 h时间点上差异显著(P<0.05)。

图7 26 ℃下口灌恩诺沙星后西伯利亚鲟血清和肝脏中谷草转氨酶活性Fig.7 The activity of glutamic-oxaloacetic transaminase in serum and liver at of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at 26 ℃

26 ℃下恩诺沙星对西伯利亚鲟血清和肝脏中谷丙转氨酶活性影响见图8。与谷草转氨酶活性变化相似，0～0.5 h，鲟鱼肝脏中谷丙转氨酶活性显著高于血清中谷丙转氨酶活性(P<0.05)；1.5～120 h，鲟鱼血清中谷丙转氨酶活性均高于肝脏中谷丙转氨酶活性，4～120 h中每个时间点血清中的谷丙转氨酶活性均显著高于肝脏中谷丙转氨酶活性(P<0.05)。

图8 26 ℃下口灌恩诺沙星后西伯利亚鲟血清和肝脏中谷丙转氨酶活性Fig.8 The activity of glutamic-pyruvic transaminase in serum and liver of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at 26 ℃

3 讨 论

3.1 谷草转氨酶和谷丙转氨酶在生物体内的代谢机理

谷草转氨酶和谷丙转氨酶是动物机体中参与药物代谢的两个关键的转氨酶，它们在机体蛋白质代谢中起重要作用[15-16]。二者均为非特异性免疫功能酶，但它们存在的组织不同[17-20]，谷草转氨酶广泛分布于各个组织器官，而存在于肝细胞线粒体中较多，细胞质和线粒体中的谷草转氨酶是保证苹果酸穿梭作用的重要酶系之一；谷丙转氨酶主要存在于各组织细胞中，只有少量释放入血液中[21-22]。谷草转氨酶与谷丙转氨酶活性的大小不仅反映氨基酸代谢程度的强弱，其活性变化与肝细胞的炎症、变性等也密切相关；血清中的转氨酶活性亦可表征肝功能是否受到损伤，因此血清和肝脏中的谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性变化均为反映肝功能正常与否的主要敏感指标，可借以评价药物的毒副作用[10]。

谷草转氨酶和谷丙转氨酶的主要作用是催化氨基酸生成酮酸。谷草转氨酶催化谷氨酸与草酰乙酸的转氨作用，谷丙转氨酶催化谷氨酸与丙氨酸的转氨作用。当机体中谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性较弱时，转氨作用较弱；反之，当机体中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性较高时，加快尿素生成，转氨作用相应增加，联合脱氨作用容易进行，氨基酸的氧化分解作用增强，减少氨基酸代谢产物对机体的毒害，从而保持机体的稳定[9,17,23]。通过对血清及肝脏中转氨酶活性的检测，可以查明机体肝功能是否健康。健康血清中这两种酶的活性均不高[24]。

3.2 不同温度下口灌恩诺沙星对西伯利亚鲟血清和肝脏谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性的影响

在本试验中，口灌10 mg/kg恩诺沙星，15、26 ℃条件下西伯利亚鲟血清和肝脏中谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性均有所升高。15 ℃下西伯利亚鲟血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性最大值分别出现在给药后的24 h和6 h，而26 ℃下谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性最大值出现在36 h和6 h。15 ℃下西伯利亚鲟肝脏中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性最大值出现在0.5 h和1.5 h，而26 ℃下谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性最大值则分别出现在2 h和36 h。这说明低温下诱导谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性达到峰值的时间较高温更短。

由峰值看，15 ℃下血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的峰值为(199.73±6.06) U/mg和(66.73±3.71) U/mg，显著低于26 ℃下血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性的峰值[(236.02±10.29) U/mg和(286.93±24.50) U/mg]。与血清指标不同，15 ℃下肝脏中谷草转氨酶的峰值[(158.10±14.25) U/mg]与26 ℃下谷草转氨酶的峰值[(182.79±18.90) U/mg]差异显著(P<0.05)，但谷丙转氨酶活性峰值在两个温度下差异不显著(P>0.05)。试验结果表明，谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性在高温下的峰值均高于低温下的峰值。说明谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性在高温下更易被诱导。

在两个温度下，西伯利亚鲟血清和肝细胞内谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性随时间推移而升高，之后则趋于平缓，这与乳酸诺氟沙星对南方大口鲇(Silurussoldatovimeridionalis)[25]肝脏谷草转氨酶活性的影响和高效氯氰菊酯杀虫剂对鲫(Carassiusauratusauratus)[26]体内谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性的影响相似。在低温下6～24 h，血清中谷草转氨酶活性高于肝脏，而随着时间延长，肝脏中谷草转氨酶活性又高于血清，说明药物未对鱼体造成损伤；但高温18～36 h，血清中谷草转氨酶活性一直高于肝脏。与谷草转氨酶相似，谷丙转氨酶低温下从0.25 h开始肝脏中谷丙转氨酶活性显著高于血清，但高温下血清中的谷丙转氨酶活性显著高于肝脏。这是因为在高温下，肝细胞受到药物刺激，产生了一定的应激反应，细胞膜的通透性增大，肝细胞内这两种酶的活性降低，导致大量谷草转氨酶和谷丙转氨酶渗入血液，致使肝脏中的谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性明显下降[25]。试验结果表明，实际生产中，在应用有效药物含量之前，要充分考虑到环境因素。高温天气下，要适当减小用药量，尽量避免药物对西伯利亚鲟机体带来的影响。