香豆素衍生物联合天麻素在抑制谷氨酸诱导神经细胞损伤中的作用

齐 宇, 李红侠, 马骋晨, 吴善潘, 刘 宇

(宿州学院 生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000)

谷氨酸(glutamic acid，Glu)是中枢神经系统信号传递的主要递质之一，对维持中枢神经系统的稳定具有重要作用[1]，但当其浓度过高时会引发氧化应激反应，产生大量氧化中间产物，导致线粒体功能受损，进而产生更多的氧自由基，加重细胞损伤、衰老和死亡。近年来研究发现，脑缺血[2-3]、肌萎缩侧索硬化[4]、帕金森病[5]、阿尔茨海默病[6]等神经性疾病均是由谷氨酸释放量过高引起的，脑组织中的神经细胞损伤是以程序性死亡形式进行的[7-10]。

香豆素又名1,2-苯并吡喃酮[11]，在植物界中广泛存在，提取简单，且荧光量子产率高[12]，香豆素及其衍生物是中药成分中必不可少的[13-14]。研究表明，香豆素衍生物(CD)具有提高免疫力、抗炎、抗菌、抗癌、抗阿尔茨海默病、抗帕金森病等多种生理活性。近年来关于香豆素的结构修饰备受研究者们关注，而哌嗪是含氮杂环碱性官能团，可增加药物的水溶性、碱性、稳定性等，能够提高药物的生物学性质[15]。天麻素(Gastrodin)也称天麻苷，是中药块茎天麻中皂苷类的主要化学成分[16]，在天麻的活性成分中含量最高，具有抗惊厥、镇痛、抗中枢神经系统衰老、抗炎、增加脑血流量[17-19]等作用，临床上多用于治疗神经退行性疾病、头晕等[20-21]。有研究证实，天麻素还可以抗氧化、抗自由基以及保护细胞膜、抗凋亡、调节神经递质，对神经元损伤具有保护作用[22]。天麻素还能对神经毒性损害起修复作用[23]。

PC12细胞具有交感神经元特性，来源于鼠肾上腺髓质的嗜铬瘤，广泛用于神经细胞体外实验研究。本实验以谷氨酸诱导PC12细胞建立模型，通过加入CD和天麻素，研究二者协同作用对神经细胞的保护作用，为脑部重大疾病的治疗提供借鉴依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂与材料

扫描酶标仪：Sunrise，奥地利TECAN；流式细胞仪：C6，美国BD；CO2培养箱：Heracel，美国Kendro；倒置荧光显微镜：CX-40，日本OLYMPUS。

DMEM培养基：南京化学试剂有限公司；新生牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶、谷氨酸和MTT：Sigma公司；双抗：南京化学试剂有限公司；香豆素衍生物(CD)：宿州学院化学实验室；谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和丙二醛检测试剂盒：南京建成生物公司；PC12细胞株：中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞存活率测定

将对数生长期的PC12细胞，按每孔1×105个 细胞培养于 96 孔板中，每孔加入100 μL，待细胞贴壁后，分别加入0.0、2.5、5.0、10.0、25.0 μmol/L的天麻素或0.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μmol/L的CD。细胞存活率测定步骤如下：加药完成后继续培养(培养箱温度为37 ℃，CO2体积分数为5%)24 h后每孔加5 mg/mL的MTT 15 μL，4 h后将每孔的液体完全吸走，再加入150 μL的二甲亚砜，于水平摇床震荡8～10 min，用酶标仪检测 490 nm 处的吸光度值，细胞存活率=用药后490 nm处吸光值/用药前490 nm处吸光值×100%。该过程可筛选出药物的最佳浓度。

后续实验分为对照组、模型组、天麻素组和联合组进行。将对数生长期的PC12细胞，按每孔1×105个 细胞培养于 96 孔板中，每孔加入100 μL，待细胞贴壁后，对照组加入100 μL的完全培养基；模型组加入100 μL含谷氨酸的完全培养基；天麻素组为最佳浓度天麻素加入1 h后，再加入谷氨酸；联合组为先加入最佳浓度天麻素和CD 1 h后，再分别加入谷氨酸。所有谷氨酸浓度均为15.0 mmol/L[24]。细胞存活率测定步骤同上：细胞存活率=用药组或模型组490 nm处吸光值/对照组490 nm处吸光值×100%。该过程可筛选出CD的最佳配伍浓度。

实验重复3次。

1.2.2 相关指标的测定

取对数生长期的PC12细胞铺于6孔板中，细胞浓度为1×105个/mL，于温度为37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养12 h，按照实验设定的方案(对照组、模型组、天麻素组、CD组、联合组)加药，24 h后终止培养，测定SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)、GSH-PX(谷胱甘肽过氧化物酶)的活性(按照SOD、MDA、GSH-PX试剂盒的说明书进行操作)，在532 nm下测定其吸光度值，根据说明书的公式计算。重复实验3次。

1.2.3 细胞凋亡检测

将对数生长期的PC12细胞接种于6孔板(2×108个/L)，实验分组同1.2.2，加药培养24 h，对照组加相同量的细胞培养基。培养结束后将细胞收集，PBS(冷的)漂洗2次，悬浮于200 μL Binding Buffer，再加入5 μL Annexin V-FITC/PI和5 μL PI轻振混匀，10 min后，再加入Binding Buffer 300 μL室温避光反应5 min，上机检测。用Flowjo 7.6.1(FACSCA2BUR, Becton Dickinson, USA)软件进行数据分析并出图。实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 药物对细胞存活率的影响

PC12细胞经不同浓度0.0、2.5、5.0、10.0、25.0 μmol/L的天麻素处理后存活率分别为(95.42±1.23)%、(98.78±0.98)%、(93.75±0.74)%、(81.25±0.85)%和(73.75±0.87)%，因此，天麻素的最佳浓度为2.5 μmol/L(此浓度下细胞存活率最高)；细胞经药物CD(0.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μmol/L)处理后的存活率分别为(95.42±1.23)%、(73.56±0.56)%、(85.24±0.38)%、(80.43±0.93)%和(71.79±1.29)%，因此，选择浓度为5.0、10.0和20.0 μmol/L的CD分别与天麻素(2.5 μmol/L)联合应用于谷氨酸处理的PC12细胞上。结果见表1。

由表1可知，经过15.0 mmol/L的谷氨酸处理24 h后的模型组细胞存活率为(60.26±1.97)%，比对照组低35.16%，具有统计学差异(P<0.05)；经天麻素(2.5 μmol/L)干预，再经谷氨酸处理的PC12细胞存活率明显增高，为(87.38±0.14)%，而CD联合天麻素(2.5 μmol/L)后细胞存活率更优，其中CD配伍浓度为10 .0 μmol/L时，细胞存活率最高，为(93.78±0.93)%。因此，与天麻素(2.5 μmol/L)配伍的最佳CD浓度为10.0 μmol/L。

表1 药物对PC12细胞存活率的影响

2.2 药物对SOD、GSH-Px和MDA的影响

由表2可知，模型组与对照组比较，SOD、GSH-Px和MDA含量均具有极显著差异性。药物处理组与模型组比较，其SOD、GSH-Px和MDA含量均有明显变化。天麻素(2.5 μmol/L)与CD(10.0 μmol/L)组协同作用后，GSH-Px和SOD的活力均高于模型组，分别是模型组的2.16倍和1.67倍，且达到极显著差异，也高于2种药物单独作用的结果。MDA的含量降低，低于模型组2.33倍，也达到了极显著差异。说明二者的协同，保护了受损的细胞。

表2 药物对GSH-Px、SOD和MDA的影响

2.3 药物抑制谷氨酸诱导的PC12细胞凋亡

使用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术，24 h后检测各组PC12细胞的凋亡变化。图1是流式细胞仪的散点图，图中左下方象限表示活细胞，即FITC-/PI-；右下方象限表示早期细胞凋亡，即FITC+/PI-；右上方象限表示晚期凋亡，即FITC+/PI+；左上方象限表示死亡细胞，即FITC-/PI+。

由图1可以看出，对照组细胞早期凋亡率是3.06%，晚期凋亡率是2.50%，细胞凋亡率低，损伤少；模型组细胞的早期凋亡率是12.60%，晚期凋亡率是12.80%，与对照组比晚期凋亡率增多；天麻素(2.5 μmol/L)处理的细胞，早期凋亡率是8.41%，晚期凋亡率是10.80%，与模型组比较凋亡率明显降低；CD(10.0 μmol/L)处理的细胞，早期凋亡率是7.88%，晚期凋亡率是9.95%，和天麻素的效果相近，凋亡的细胞也较模型组低。天麻素(2.5 μmol/L)和CD(10.0 μmol/L)协同作用时，早期凋亡率是8.08%、晚期凋亡率是6.01%，细胞凋亡率为14.09%，较模型组的25.40%降低了11.31%，早期凋亡的细胞与药物单独作用变化不明显，但晚期凋亡明显低于这两种药物单独作用，说明二者协同作用对谷氨酸损伤的细胞有明显的保护作用。

3 讨论

PC12细胞用于研究多种神经系统疾病，像阿尔茨海默病、帕金森病等疾病。谷氨酸作为一种非必须氨基酸，是中枢神经系统内主要的兴奋性神经递质，对神经系统的正常功能活动起着重要的维持作用。已有研究证实，谷氨酸为脑内重要的兴奋性神经递质，如过度激活相应受体会造成继发性、氧化性神经毒性，引起胞内神经毒性级联反应，导致细胞损伤、衰老和死亡[25]。氧化应激在细胞功能调解中起着重要作用，多种神经退行性疾病的发病机制都与氧化应激关系密切，氧化应激的发生进而能抑制细胞凋亡，在神经系统疾病防治中具有重要意义[26]。实验结果显示，15.0 mmol/L的谷氨酸处理的PC12细胞24 h后，细胞存活率为(60.26±1.97)%，与对照组相比有显著差异(P<0.01)，谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活力明显下降，丙二醛含量明显上升，细胞的凋亡率明显升高。

有研究表明，天麻素对H2O2损伤的PC12细胞具有显著保护作用，天麻素预处理组能够抑制谷氨酸诱导的凋亡，多种CD具有显著的神经保护作用[27-28]。本实验利用天麻素(2.5 μmol/L)+CD(10.0 μmol/L)培养PC12细胞24 h后，与模型组比较，细胞存活率增加25.47%，谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶等指标也均增加，分别是模型组的2.16倍和1.67倍，且达到极显著差异，高于2种药物单独作用；MDA的含量降低，低于模型组2.33倍，达到了极显著差异；细胞凋亡率降低了11.31%。实验结果表明二者的协同作用保护了受损的细胞。

综上所述，天麻素和香豆素衍生物协同作用能够保护谷氨酸诱导的PC12细胞损伤，其机制可能与拮抗谷氨酸诱导的氧化应激有关。研究结果为天麻素、香豆素衍生物作为治疗脑的神经性疾病药物提供了理论参考。