西北地区高床平养模式下5种球虫疫苗免疫效果的对比分析

王 鹏 李海娟 罗伟光 徐源佑 薛甜霞 董 瑞 蒋天琪 边海霞

（宁夏晓鸣农牧股份有限公司，宁夏银川 750021）

鸡球虫病是由多种艾美耳球虫寄生于鸡的肠上皮细胞引起的原虫病。该病呈全球性分布，是集约化养鸡生产中最常见且危害最严重的寄生虫病[1]。目前，控制鸡球虫病的方法主要是使用抗球虫药物和球虫病活疫苗，但抗球虫药物存在很多问题[2]。因此，球虫疫苗的使用是球虫防控的一种理想措施。市面上已有多种球虫疫苗可供使用，但球虫卵囊排出外界只有在适宜的条件下才能正常进行孢子化，温度和湿度对球虫免疫效果具有重要的影响[3]。本公司地处西北地区，外界气候相对干燥且鸡舍均采用高床平养。虽然目前市场上有多种球虫疫苗可供使用，但按照常规使用方法和剂量免疫后效果参差不齐，仍达不到理想状态，鸡群球虫感染及肠炎的问题仍时有发生，对鸡只的生长、生产性能和鸡群健康造成严重影响。本试验对市场上5种球虫疫苗进行免疫后效果评估，从而为筛选最适合本公司的球虫疫苗及为鸡群建立良好的球虫免疫保护提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物及厂区。本试验在宁夏某鸡场进行，试验动物均为2日龄海兰褐蛋鸡，其中一栋舍为球虫疫苗免疫组，另一栋舍为未免疫对照组，2栋舍均采用高床平养模式，且舍内均配有水线、料线、自动喷雾加湿和控温器等相关设备，鸡舍的整体条件良好。

1.1.2 试验疫苗。分别选取4个不同厂家5种球虫疫苗作为试验疫苗，分别标记为 A、B、C、D、E 组，其中A、B为同一个厂家的2种不同效价的球虫疫苗，A为4价，B为4+2价（即B为A在原有的4种虫卵基础上再增加2种虫卵）。

1.2 试验方法

1.2.1 球虫卵囊计数。采用血球计数法和麦氏计数法同步进行卵囊计数，计数时实验室与免疫现场以及第三方检测同步进行。

1.2.2 粪便中球虫卵囊检测计数方法。球虫首免的卵囊于免疫后第6、7、8天，选择其中2 d进行卵囊计数即可；自然二免组结果于免疫后第13、14、15天，选择其中2 d进行检测；人工辅助二免组应于饲喂人工孵育粪便后的第6、7、8天，选择其中2 d进行检测。

按照盲肠粪∶小肠粪为1∶4的比例收集粪便，收集5堆盲肠粪和20堆小肠粪。将采集到的新鲜粪便装入100 mL烧杯中，充分混合均匀。称量3 g混合均匀的粪便放入烧杯，抽取42 mL饱和盐水，先加入部分饱和盐水，用勺子将粪便搅碎混匀后分别加入剩余的盐水冲洗杯壁。用胶头滴管吹打均匀混悬液后，吸取混悬液加入麦氏计数板中，静置5～10 min后分别计数2个计数室内的卵囊数，取平均值，即每克粪便中的卵囊数（OPG）。

1.3 免疫操作方法

1.3.1 球虫疫苗首次免疫操作方法。根据鸡群存栏量按1羽份使用量准备所需球虫疫苗。免疫前需控料3～4 h，其间保证正常供水，按照1 000羽份添加20 kg饲料、2 kg水、20 g 4%食品红溶液进行疫苗稀释，根据红色素均一附着饲料情况判断是否拌匀，将饲料全部混匀为止，最后将拌料总量（饲料、水的总和）按鸡数分配至各间，均匀加入每个料盘中，确保鸡群同步开食。球虫免疫期间确保前21 d湿度不低于40%、温度不低于30℃。

1.3.2 自然啄食粪便二免。在首次免疫后第6～9天结束，其间将每日1/3饲料饲喂量撒在牛皮纸上诱导小鸡啄食垫纸上粪便，从而完成自然啄食粪便中的球虫，进行二次免疫。

1.3.3 人工辅助二免。第一步：根据鸡只数量，按照每1 000羽份收集400 g新鲜粪便确定所需鸡粪量。第二步：在鸡群球虫疫苗免疫后第6天下午清除架下陈旧粪便，在免疫后第7天收集架下新鲜粪便。第三步：对粪便进行孢子化孵育处理，按1 000羽份收集400g鸡粪，喷洒1mL安灭杀、200mL水以及600g辅料进行配制。第四步：鸡群控料2 h以上，将孵育好的粪便混合物与饲料（按照1 000羽加入5～10 kg饲料的比例）拌匀后，按鸡数分配至各间，均匀加入每个料盘中，确保鸡群同步开食。

1.4 不同介质对球虫孢子化孵育的方法设计

设计谷糠、木糠、沙子3个处理，参照1.3.3进行配制，将混合物平铺在塑料膜上，厚度以1 cm左右为宜，每隔4 h加湿1次粪便混合物，喷水后翻搅均匀，将水充分混合进孵育介质中。孵育至少48 h后，根据镜检结果确定孵育率较好的孵育介质用于人工辅助二免。

1.5 分组及免疫

将球虫免疫试验鸡群随机分为6组，其中A～E组为5种不同疫苗免疫组，F组为无球虫免疫空白对照组，具体分组见表1。

表1 鸡球虫免疫分组及免疫情况

2 结果与分析

2.1 实验室球虫疫苗计数结果

球虫免疫试验前，采用血球计数与麦氏计数法对试验使用的5种疫苗进行球虫卵囊数量的自检与第三方盲样检测。从表2可以看出，第三方检测与自检所测球虫疫苗中卵囊数量与疫苗出厂值基本相符，检测合格。

表2 5组不同球虫疫苗中卵囊数检测结果

2.2 疫苗首免后粪便中球虫卵囊计数结果对比

收集首次免疫后第6、7、8天粪便，进行粪便中球虫卵囊数的计数以及球虫疫苗免疫后效果评估。结果显示，参考卵囊数首免后在2万～10万个/g标准的前提下，5种不同球虫疫苗的首次免疫均成功（表3）。在单一考虑球虫卵囊数的情况下，疫苗效果表现为 C＞A＞D＞B＞E。

表3 首免后粪便中球虫卵囊数量检测结果 单位：（个·g-1）

2.3 自然二免与人工二免效果对比以及不同孵育介质效果对比

在B、C、D、E组球虫疫苗首免成功的前提下，B组和E组进行球虫自然二免与人工拌粪二免对比，C组（Ⅱ和Ⅲ）与D组（Ⅱ和Ⅲ）进行疫苗拌料二免。

二免后粪便中球虫卵囊计数结果显示：在现有养殖模式（高床平养）、环境（西北地区外界环境湿度低）条件下，B组球虫自然二免与人工拌粪二免、C组与D组疫苗拌料二免免疫后检测OPG，卵囊数较低，在0～10 000个/g之间，即B、C、D组的第二次球虫免疫均失败，E组自然二免失败但人工二免OPG较高，E组人工拌粪二免成功。总体来讲，在现有条件下人工拌粪辅助二免效果优于自然二免，即人工辅助二次免疫对鸡球虫病具有良好的免疫效果[4]（表4）。

表4 4种球虫疫苗首免、自然二免及人工拌粪二免卵囊数对比 单位：（个·g-1）

2.4 人工辅助二免不同孵育介质对粪便中球虫卵囊孢子化率的对比结果

谷糠、木糠、沙子3种不同孵育介质孵育效果以及拌粪免疫后对鸡只肠道损伤评估试验结果显示：木糠组球虫孢子化孵育率最高，为75%，其次为谷糠组（70%）和沙子组（50%）（图 1）。 3种孵育介质对肠道损伤情况评估对比显示：沙子组优于谷糠组，优于木糠组。木糠和沙子作为孵育介质对鸡群的健康可能存在不可控生物安全因素，且孵育过程中臭味较重影响鸡群采食量。综上所述，人工二免孵育介质应首选粒度适中的谷糠。

3 结论与讨论

球虫的防控主要依靠药物和疫苗免疫2种方式。鸡群长期使用球虫药易产生严重的耐药性，因而更适合使用活疫苗进行免疫预防。活疫苗通过球虫虫株在鸡的肠道黏膜上进行4～6 d的内生性发育，刺激机体形成基础抗球虫的免疫力，并随粪便排出后代卵囊，这些卵囊在垫料中经适宜的温度和湿度进行孢子化后，部分卵囊被鸡啄食，起到加强免疫的作用，如此重复感染2～3次后，机体才能形成持久的免疫力[5]。因此，反复接种球虫卵囊对于增强鸡只对球虫的免疫力是一个较好的方法[6]。在本公司现有高床平养饲养模式下，2日龄雏鸡免疫试验中的5种球虫疫苗均可达到球虫首免的效果；在首免成功的前提下，通过鸡只自然啄食粪便二免和人工辅助二次免疫试验发现，自然二免免疫失败，而人工辅助二免效果优于自然二免，即人工辅助二免对鸡球虫病具有良好的免疫效果；在球虫卵囊孢子化孵育试验中，谷糠、木糠、沙子3种不同孵育介质孢子化孵育效果以及对肠道损伤的综合对比结果表明，人工二免孵育介质应首选粒度适中的谷糠。

综上所述，本试验中所使用5种球虫活疫苗中，E组为临床试验下最适用于本公司高床平养模式下球虫免疫的疫苗，人工孢子化孵育后拌粪二免效果优于自然啄食粪便二免，且在人工辅助二免中选用粒度适中的谷糠作为介质可使球虫的二次免疫效果达到最佳。