响应面优化复方铁皮石斛提取物饲料添加剂工艺研究

贺 莹， 冯彩平

（吕梁学院生命科学系，山西吕梁 033000）

铁皮石斛（Dendrobium officinale）是一种中草药植物，属被子植物门，其根茎直立呈圆柱形，不分枝具有多节；花期是3 ～7 月，有很高的观赏价值，适宜在凉爽、相对湿润、空气流通的环境下生长。 近年来有关铁皮石斛的研究已成为生命科学研究的热点， 国内外学者从各石斛植物中分离鉴定出约100 种化合物（郑成江等，2010）。我国主要研究的是铁皮石斛的成分与功能（蔡鹃等，2014）。目前， 兽药正朝着无农药残留、 疗效高等方向努力， 中草药作为饲料添加剂具有增强动物体质和抗应激能力、 改善动物肌肉等功效 （闫如霞等，2021；肖琎等，2016），而且还具有无药物残留、无污染等优点（曹日亮等，2020；玄家洁，2018）。

本试验通过参考国内外铁皮石斛提取物及复方饲料添加剂制备工艺的研究， 以铁皮石斛为原料，采用恒温水浴提取法、离心分离、浓缩、干燥、压片等方法制作复方饲料添加剂。 通过单因素试验先确定响应面的因素和水平， 经过响应面优化试验设计， 确定铁皮石斛提取物复方饲料添加剂的最佳配方，并对其质量进行验证，以期为铁皮石斛复方饲料添加剂在动物养殖业推广提供一定的帮助（Kuorwel 等，2011；刘洪明，2009）。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 铁皮石斛条， 产自安徽省霍山县；柠檬酸，碳酸氢钠；氢甜菊糖、乳糖、聚乙二醇6000、PVP K30（食品级），河南万邦实业有限公司。

1.2 仪器与设备 MiniiG2500 微孔板离心机，长沙综仪生物科技有限公司; LED 小型中药打粉机， 湖南省长沙市常宏制药机械设备厂；HPX－9052MBE 电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HC-100 电子天平，温州科尔特计量检测仪器有限公司；PHS－3E pH 计， 上海精密化学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 铁皮石斛提取物粉末制备工艺流程 新鲜铁皮石斛条→清洗→干燥→粉碎→过筛→恒温水浴浸提→过滤→提取液（滤渣重复提取2 次）→合并3 次提取所得滤液→浓缩→沉淀→离心→沉淀干燥→粉碎→过筛→提取物粉末（张诗航，2018；陈晓梅等，2013）。

操作要点：新鲜铁皮石斛条洗净，于87 ℃烘干至恒重，粉碎后过80 目筛，得铁皮石斛粗粉，称取适量铁皮石斛提取物粗粉，按照1:20 的料液比加入蒸馏水，于70 ℃水浴加热、搅拌、浸提2 h，过滤， 滤渣同法提取2 次， 合并3 次提取所得滤液，于旋转蒸发仪75 ℃浓缩后，加入95%乙醇，先沉淀，后离心10 min，然后放入干燥箱50 ℃烘干，再粉碎过80 目筛，即得铁皮石斛提取物粉末。

1.3.2 复方饲料添加剂制备工艺流程 收集铁皮石斛提取物→加入酸源、崩解剂、填充剂、黏合剂、甜味剂等混合均匀→压片；收集铁皮石斛原料粉→加入碱源、崩解剂、填充剂、黏合剂、甜味剂等混合均匀→压片，再将两粒混压（宋文惠等，2020）。

操作要点：称取铁皮石斛提取物粉末、柠檬酸及其他辅料均匀混合，于干燥箱50 ℃烘干，制粒。称取铁皮石斛提取物、 碳酸氢钠及其他辅料均匀混合（铁皮石斛提取物添加量定为10%，酸碱配比定为1:0.8，泡腾崩解剂添加量定为50%，甜菊糖定为2%，PEG 6000 定为5%）， 加适量黏合剂（5% PVP K30）制软材后制粒，放入干燥箱50 ℃烘干， 将两片混压制作3.9 g 的铁皮石斛提取物复方饲料添加剂（黄华娟等，2021）。

1.3.3 铁皮石斛提取物复方饲料添加剂配方优化单因素试验 选择添加铁皮石斛提取物添加量（2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%）， 添加酸碱配比质量（1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2），崩解剂添加量（30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%）， 甜味剂添加量 （1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3%、3.5%、4%），其他配方按1.3.2 执行，进行单因素试验， 用综合评价作为标准来确定复方饲料添加剂中各单因素的添加量（王梦娇等，2020）。

1.3.4 响应面法配方优化试验设计 在单因素的基础上， 用响应面法对铁皮石斛复方饲料添加剂制备配方优化，选择铁皮石斛提取物添加量（A），酸碱配比（B），泡腾崩解剂添加量（C）和甜菊糖添加量（D）四个因素，以（Y）综合评分为因变量，设计4 因素3 水平的Box-Benhnken 组合试验 （王苗苗等，2019；余彦国等，2018），响应面法试验因素与水平见表1。

表1 响应面法试验因素及水平

1.3.5 综合评价 依据表2 的评分标准， 分别对铁皮石斛复方饲料添加剂外观色泽、 口感和汤色3 个指标进行综合评分。

表2 铁皮石斛提取物复方饲料添加剂综合品质（感观评分）的评分标准

1.3.6 铁皮石斛复方饲料添加剂的质量检测 外观状态：复方饲料添加剂表面光滑，具有石斛叶特有的颜色，溶于水后颜色较鲜亮。 pH：准确称取一片复方饲料添加剂，放入100 mL 蒸馏水中使其崩解，待崩解完全，气泡不再冒出后，用pH 广泛试纸测定其pH（王文宝等，2020；郑丹丹等，2016）。多糖含量：按《兽药质量标准2017 年版（中药卷）铁皮石斛“含量测定”项下》规定执行（陈静慧等，2019；王涛等，2011）。砷：按GB/T 13079 饲料中砷的测定方法。 铅：按GB/T 13080 饲料中铅的测定方法。

1.4 数据处理 利用Origin 绘图软件绘制单因素的数据趋势图，通过Design-Expert 软件进行响应面试验设计与结果分析（林雪媛等，2019）。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛提取物复方饲料添加剂配方优化单因素试验

2.1.1 铁皮石斛提取物添加量的确定 由图1知，铁皮石斛提取物添加量越高，复方饲料添加剂颜色越均匀， 有较浓的石斛香气， 溶解后口感越好， 但加入过多口感会变得苦涩。 当配方中铁皮石斛提取物添加量为8% ～12%时，颜色均匀，溶解后颜色均较鲜亮，均带有纯正的石斛风味，口感适中。故选择铁皮石斛提取物添加量为8%、10%、12%进行后续试验。

图1 铁皮石斛提取物添加量对复方饲料添加剂综合品质的影响

2.1.2 酸碱比例（柠檬酸与碳酸氢钠）的确定 由图2 和图3 得出，随着碳酸氢钠添加量的增加，复方饲料添加剂溶解时崩解时间会越来越长，pH 也快速增大， 但过高的碳酸氢钠用量会导致口感不佳。 所以当柠檬酸与碳酸氢钠质量比为1:0.8 时，崩解时间较短，pH 显酸性，酸甜口感较好，所以确定柠檬酸与碳酸氢钠比为1:0.8、1:0.9、1:1 进行后续试验。

图2 酸碱比对复方饲料添加剂溶解后崩解时限的影响

图3 酸碱比对复方饲料添加剂溶解后pH 的影响

2.1.3 泡腾崩解剂添加量的确定 由图4 和图5可得， 复方饲料添加剂的崩解时间随泡腾崩解剂添加量的增加而逐渐缩短。 当泡腾崩解剂添加量为45% ～60%时， 复方饲料添加剂崩解时间较短，故选择泡腾崩解剂添加量45%、50%和55%进行后续试验。 泡腾崩解剂添加量对pH 的影响不明显，pH 均在5.1 ～5.6。

图4 泡腾崩解剂添加量对复方饲料添加剂溶解后崩解时限的影响

图5 泡腾崩解剂添加量对复方饲料添加剂溶解后pH 的影响

2.1.4 甜味剂（甜菊糖）添加量的确定 由图6 得出，随着甜菊糖添加量的增加，复方饲料添加剂的甜味会变得更浓郁，但加入超过3%的甜菊糖，复方饲料添加剂呈现单一的味道， 甜味会变得较淡直至消失，因此选择含量为2.0%、2.5%、3.0%进行后续试验。

图6 甜味剂（甜菊糖）添加量对复方饲料添加剂综合评价的影响

2.2 响应面法优化试验

2.2.1 响应面试验结果 响应面试验结果见表3。

表3 响应面法试验组合及评分

2.2.2 回归模型的建立 用Design Expert 软件对响应面结果多元回归分析， 得到铁皮石斛提取物复方饲料添加剂的综合评分（Y）与各因素的二次回归模型为：Y ＝94.80+2.58A+3.75B-5.58C+3.25D -0.25AB -1AC -2AD +1.75BC -2.75BD +2.50CD-8.57A2-4.32B2-5.07C2-5.07D2。

上式中， 各项系数绝对值的大小表示各因素对铁皮石斛提取物复方饲料添加剂综合评分的影响程度，系数的正负表示该影响因素的方向。

从表4 中回归模型方差分析可知， 模型的P＝0.0001＜0.01，说明模型有高度显著性，铁皮石斛复方饲料添加剂的综合质量在不同因素下存在显著性差异；失拟度P＝0.0701＞0.05，说明拟合程度在选定的因素水平范围内。 该模型可用于分析和预测试验结果；A、B、D、C 的影响极显著（P＜0.01）。

表4 二次回归模型方差分析

2.3 响应曲面分析 曲面的倾斜程度可反映各种因素对铁皮石斛提取物复方饲料添加剂综合品质的影响。 等高线图的形状可以表示各因素之间的交互作用是否显著， 椭圆状表明因素的交互作用显著，圆形状表示交互作用不显著，结合二次回归模型方差分析，从图7、图8 可以看出，铁皮石斛提取物量添加量和酸碱比例、 铁皮石斛提取物添加量和甜菊糖添加量交互作用不显著；从图9、图10 可以看出铁皮石斛提取物添加量与铁菊糖添加量、 酸碱配比与泡腾崩解剂添加量交互作用显著； 从图11、 图12 可以看出酸碱配比与甜菊糖添加量、 泡腾崩解剂添加量与甜菊糖添加量交互作用极显著。

图7 铁皮石斛提取物添加量与酸碱配比交互作用的等高线与曲面

图8 铁皮石斛提取物添加量与泡腾崩解剂添加量交互作用的等高线与曲面

图9 铁皮石斛提取物添加量与甜菊糖添加量交互作用的等高线与曲面

图10 酸碱配比与泡腾崩解剂添加量交互作用的等高线与曲面

图11 酸碱配比与甜菊糖添加量交互作用的等高线与曲面

图12 泡腾崩解剂添加量与甜菊糖添加量交互作用的等高线与曲面

2.4 最佳配方验证 通过响应面试验优化后，得出铁皮石斛提取物复方饲料添加剂的最佳配方为：铁皮石斛提取物添加量10%，酸碱比1:0.8，泡腾崩解剂添加量45%，甜菊糖添加量2.5%；预测值的综合评分96 分，在此条件下重复3 次，复方饲料添加剂的综合评分为95.6 分，与预测值无显著性差异， 说明通过响应面优化的回归方程模型及最佳制备工艺可靠。

2.5 复方饲料添加剂质量检测结果 将按照最佳制备工艺制得的铁皮石斛复方饲料添加剂，根据1.3.6 各项指标进行质量检测。 可以得出，在最佳制备工艺条件下制得的复方饲料添加剂表面光滑，外形整齐，pH 为4.6，多糖含量为36.4%，砷含量为≤10.0 mg/kg，铅含量为≤40.0 mg/kg。

3 结论

本试验以铁皮石斛为原料， 首先采用恒温水浴提取法提取铁皮石斛活性物质， 利用单因素试验， 得到了各因素对铁皮石斛复方饲料添加剂综合品质影响趋势图， 在此基础上通过响应面优化试验设计，建立回归模型，并验证了模型的合理性和可靠性，得到最佳制备工艺：铁皮石斛提取物添加量10%，酸碱比1:0.8，泡腾崩解剂添加量45%，甜菊糖添加量2.5%，经验证试验复方饲料添加剂的综合评分为95.6 分， 与预测值无显著性差异，可为铁皮石斛复方饲料添加剂的发展和应用提供一定的帮助。