转基因玉米深加工产品中DNA 提取方法的研究

王 辉，赵爱君，张全军

（1.中华人民共和国东营海关，山东 东营 257091；2.山东吉龙集团有限公司，山东 莱阳 265200；3.潍坊工商职业学院，山东 潍坊 262234）

0 引言

玉米作为粮食、饲料兼用的农作物，是世界农业生产的重中之重。中国作为世界第二大玉米生产国，同样对玉米的需求与日俱增。在耕地面积不变的情况下要增加玉米产量就必须将基因工程引入玉米种植，基因工程在玉米的种植中已经得到较成熟的应用。近年来，美国及加拿大等地区都研发出自己的转基因玉米品种，如Monsanto、Dekalb、Systems 等公司研制的抗除草剂、抗虫及雄性不育玉米，瑞士的先正达公司（Syngenta） 成功培育的转Bt 抗虫甜玉米[1]。与普通深加工食品一样，转基因玉米在深加工过程中其自身的DNA 也会遭受严重的破坏，伴随着加工中出现的各种物理、化学或酶因子等因素，都影响到了DNA 质量，因此玉米深加工产品中DNA 的提取技术就关乎到后期检测的可靠性。对玉米深加工产品的DNA 提取技术进行了研究，并对提取的DNA 的质量和纯度进行检测，从而确定最佳方法，为检验机构特别是出入境检验机构的检测人员检测玉米DNA 质量提供了极大方便。同时，对检测方法的标准化也具有十分重要的意义，为以后各种深加工转基因产品的DNA 提取技术提供很好的技术保障[2]。

1 试验原理

1.1 DNA 提取的原理

由于DNA 及RNA 在0.14 mol/L 的NaCl 溶液中溶解性不同（前者不能溶解而后者可溶），可将二者从破碎细胞浆液中进行分离。

样品在破碎过程中，细胞中的DNA 释放到提取液中，DNA 因此会被降解而影响得率。由于柠檬酸盐和EDTA 可抑制酶的活性，同时使蛋白质变性而与核酸分离，因此可将其加入提取液，然后再加入质量分数为0.15%的阴离子去垢剂SDS，搅拌2 h，也可用氯仿—异戊醇除去蛋白，然后离心除去蛋白质，得到核酸上清液。最后用预冷的95%乙醇将DNA 从已去除蛋白质杂质的提取液中沉淀出来[3-4]。

1.2 DNA 的分离原理

DNA 的分离采用琼脂糖凝胶电泳，电泳的驱动力靠DNA 本身的负电荷。因为DNA 带负电荷，所以它会从负极向正极移动，移动的距离与样品的分子量有关。 电泳后样品极易洗脱，区带也很容易染色，从而便于定量测定。将琼脂糖凝胶制成干膜还能够长期保存。

1.3 紫外可见分光光度法检测原理

由于DNA 和RNA 链上碱基的苯环结构在紫光区的波长260 nm 处的吸收值有最大吸收峰，因此可以选择波长260 nm 来测定DNA 或RNA 的光密度OD260，测定值不仅与DNA 或RNA 含量有关，还与其构型不同出现差异。

一般在检测同一样品的DNA、RNA 含量时会测定3 个波长下的光密度，分别为OD260，OD280，OD230，然后通过计算其比值来衡量样品的纯度。

经验证：①纯DNA 的OD260/OD280≈1.8（如果<1.6，表明样品中含有蛋白质、酚等污染物；如果>1.9，表明有RNA 污染）；RNA 的OD260/OD280为1.7～2.0（如果<1.7 时表明有蛋白质或酚污染；如果2.0 时表明样品中可能有异硫氰酸残存）；②纯RNA的OD260/OD280≈2.0。当OD260/OD280>2时可能被蛋白污染，可以通过增加酚抽提降低测定值；OD260/OD230<2可能与GIT 污染有关，说明盐分去除不充分，可通过再次沉淀并用70%的乙醇洗来处理涤。OD260/OD280的比值可用来评估核酸的纯度，OD260/OD230用来评估去除盐分的多少。

2 材料和仪器

2.1 试验材料

玉米片、爆米花，市售。

2.2 试验仪器与设备

可调式移液器（0.5～10，5～50，20～200，100～1 000 μL），离心管（1.5 mL），蓝、黄、白枪头，DK-S24 型恒温水浴锅，高速离心机，LDZX-40BI 型立式自动电热压力蒸汽灭菌器，电子天平，冰箱，琼脂糖凝胶电泳仪，凝胶成像系统分析仪，紫外可见分光光度计，比色皿等。

2.3 试验试剂

100 g/L CTAB 溶液、β - 巯基乙醇、20 mg/mL蛋白酶K、无水乙醇、70%乙醇、异丙醇、Tris 平衡酚、醋酸铵、5 mol/L 氯化钠、1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 值8.0）、0.5 mol/L EDTA溶液、苯酚∶氯仿（25∶24，V/V）、氯仿∶异戊醇（24∶1，V/V）、苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1，V/V）、琼脂糖、双蒸水、0.25 mol/L HCl溶液、0.25 mol/L NaOH溶液。

CTAB 提取缓冲液（20 g/L）：20g/L CTAB 溶液，1.4 mol/L NaCl溶液，0.1 mol/L Tris-HCl溶液，0.05 mol/L EDTA溶液，pH 值8.0，灭菌后使用。

3×CTAB 提取缓冲液：浓度0.1 mol/L Tris-HCl，25 mmol/L EDTA 溶液，2.5 mol/L NaCl 溶液，2%硫基乙醇溶液，3%CTAB 溶液，pH 值8.0，灭菌后使用。

TE 缓冲液：浓度1 mmol/L EDTA（pH 值8.0），浓度10 mmol/L Tris-HCl（pH 值7.4～8.0），灭菌后使用。

0.5×TBE 溶液：浓度0.045 mol/L Tris- 硼酸溶液，浓度0.001 mol/L EDTA 溶液，灭菌后使用。

3 试验方法

3.1 DNA 提取的试验方法

3.1.1 样品预处理

将玉米片和爆米花磨成粉待用。

3.1.2 经典CTAB 法

（1） 取4 只1.5 mL 离心管分别编号为1，2，3，4，1 和2 号管加0.1 g 玉米片粉，3 和4 号管加0.1 g爆米花粉，分别加入CTAB 缓冲液600 μL，混匀，然后加入4 μL 的蛋白酶K（20 mg/mL），充分混匀。放入65 ℃的恒温水浴中加热60 min，并保持10 min摇匀一次。

（2） 加等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），混匀。

（3） 在离心机中以转速12 000 r/min 离心10 min。

（4） 缓慢抽取上清液置于新离心管，加等体积-20 ℃下预冷异丙醇，缓慢混匀后，室温静置30 min。

（5） 在离心机中以转速12 000 r/min 再次离心10 min。

（6） 弃去上清液，加入体积分数70%冷乙醇400 μL 洗涤沉淀2～3 次。

（7） 离心管倒置于面巾纸上，自然晾干。

（8） 加入TE 缓冲液50 μL 溶解沉淀，于-20 ℃下保存。

3.1.3 CTAB 法的初步改良

（1） 取4 个1.5 mL 离心管编号1，2，3，4，分别加20 g/LCTAB 缓冲液350 μL，1 和2 号管加0.1 g玉米片粉，3 和4 号管加0.1 g 爆米花粉，再分别加20 g/L CTAB 缓冲液150 μL。

（2） 加入4 μL 蛋白酶K，充分混匀后，放入恒温水浴锅中65 ℃下水浴60 min，每10 min 混匀一次。

（3） 分别加入650 μL Tris 平衡酚溶液，颠倒混匀10 min。

（4） 在离心机中以转速12 000 r/min 离心10 min。

（5） 取上层液体置于新离心管，加苯酚∶氯仿（25∶24） 600 μL，颠倒混匀10 min。

（6） 在离心机中以转速12 000 r/min 离心10 min。

（7） 缓慢抽取上清液至新离心管，加入2 倍体积-20 ℃预冷无水乙醇，缓慢混匀后，于室温下静置30 min。

（8） 离心机中以转速10 000 r/min 离心3 min。

（9） 弃去上清液，用体积分数70%冷乙醇400 μL 洗涤沉淀3 次。

（10） 自然晾干后，加入TE 缓冲液40 μL 溶解沉淀，于-20 ℃保存。

3.1.4 CTAB 法有效改良

（1） 取4 个1.5 mL 离心管编号1，2，3，4，在1 和2 号管加人少量（至1.5 mL 离心管的最小刻度0.1 mL 处） 玉米片粉，3 和4 号管加少量爆米花粉。

（2） 加入65 ℃下预热的CTAB 提取缓冲液700 μL，充分振荡混匀，放入65 ℃恒温水浴中加热2 h。

（3） 样品冷却至室温后，加入氯仿∶异戊醇（24∶1） 600 μL，缓慢颠倒混匀约5 min。

（4） 离心机中以转速7 500 r/min 离心10 min，转移上清液至新离心管中；1 和3 号加入1/2 体积的5 mol/L NaCl，2 和4 号加入NH4Ac 调整终浓度为10 mmol/L。再加入等体积-20 ℃预冷的异丙醇，混匀，-20 ℃放置30 min。

（5） 以转速10 000 r/min 离心3 min，弃去上清液。

（6） 沉淀用70%乙醇、无水乙醇各洗涤1 次，以转速10 000 r/min 离心3 min，弃去上清液。

（7） 自然晾干后，加入TE 缓冲液50 μL 溶解沉淀，于-20 ℃保存。

3.1.5 煮沸法

（1） 取4 个1.5 mL 离心管编号1，2，3，4，1和2 号管加0.1 g 玉米片粉，3 和4 号管加0.1 g 爆米花粉。

（2） 分别加入0.25 mol/L 的NaOH 溶液100 μL，充分混匀。

（3） 沸水水浴30 s。

（4） 再加入浓度0.25 mol/L 的HCl 溶液100 μL，1 mol/L 的Tris-HCl 50 μL，充分混匀。

（5） 沸水水浴2 min。

（6） 冷却后，以转速10 000 r/min 离心12 min。

（7） 将上清液移至新的离心管中，加入等体积-20 ℃预冷的异丙醇，混匀，-20 ℃放置30 min。

（8） 以转速10 000 r/min 离心3 min，弃去上清液。

（9） 沉淀用70%乙醇、无水乙醇各洗涤1 次，以转速10 000 r/min 离心3 min，弃上清液。

（10） 自然晾干后，加入TE 缓冲液50 μL 溶解沉淀，于-20 ℃下保存。

3.2 琼脂糖电泳检测的试验方法

（1） 凝胶的配制。试验用质量分数为0.8%的凝胶。称取0.8 g 琼脂糖置于锥形瓶中，加入0.5×TBE 100 mL，电炉加热至琼脂糖全部融化，混匀备用。

（2） 凝胶的制备。首先，取质量分数为0.8%的凝胶滴入玻璃板与内槽两端边缘，使其封好，将内槽置于水平位置并将“梳子”放好。其次，将冷却到70 ℃左右的琼脂糖凝胶液倒入玻璃板的内槽中，使其慢慢展开，直至整个玻璃板表面形成均匀胶层。最后，静置冷却至凝胶完全凝固，然后垂直轻拔梳子，添加0.5×TBE 电泳缓冲液至添加了凝胶及内槽的电泳槽中，直至没过胶板为止。

（3） 加样。在凝胶板上将提取的DNA 样品和Buffer 混合。用10 μL 微量移液器将样品加入小槽内，一个样品使用一个加样头，以防污染。

（4） 电泳。将加样后的凝胶板在电压为60～100 V的电源中进行电泳操作，此时样品的移动方向为负极（黑色） 向正极（红色），直至溴酚蓝移动到距离凝胶胶板下沿约1 cm 处时，关闭电源。

（5） 染色与拍照。电泳结束后，将凝胶板取出，浸入溴化乙锭（EB） 染色约20 min，然后在紫外光照射下使DNA 显示出条带，观察条带并用紫外分析仪拍照。

3.3 紫外可见分光光度计检测的试验方法

（1） 启动紫外可见分光光度计，预热30 min。（2） 双蒸水清洗比色皿，并用吸水纸吸干，用双蒸水做对照。

（3） 设定狭缝后校零。

（4） 从成像的结果中选出各方法比较好的样品，稀释1 000 倍，记录编号和稀释度。

（5） 将盛有待测样液的比色皿放入样品室的S架上，关闭盖板。

（6） 紫外分光光度计的波长分别设定为波长260，280 nm，测定OD 值。

（7） 记录光密度值并计算出DNA 浓度和纯度。

4 结果与分析

4.1 琼脂糖电泳检测的结果

4.1.1 经典CTAB 法经典CTAB 法提取的DNA 测定结果见图1。

图1 经典CTAB 法提取的DNA 测定结果

4.1.2 CTAB 法初步改良

CTAB 法初步改良1 提取的DNA 测定结果见图2。

图2 CTAB 法初步改良1 提取的DNA 测定结果

4.1.3 CTAB 法有效改良

CTAB 法有效改良1 提取的DNA 测定结果见图3。

图3 CTAB 法有效改良1 提取的DNA 测定结果

4.1.4 煮沸法

煮沸法提取的DNA 测定结果见图4。

图4 煮沸法提取的DNA 测定结果

4.2 紫外可见分光光度计检测的结果

玉米片各方法提取DNA 的OD 值测定结果如下。

经典CTAB 法和CTAB 法的初步改良提取DNA的OD 值见表1。

表1 经典CTAB 法和CTAB 法的初步改良提取DNA 的OD 值

爆米花各方法提取DNA 的OD 值测定结果如下。

经典CTAB 法和CTAB 法的初步改良提取DNA的OD 值见表2。

表2 经典CTAB 法和CTAB 法的初步改良提取DNA 的OD 值

4.3 讨论

4.3.1 琼脂糖电泳结果讨论

由电泳图明显可看出，煮沸法远不如CTAB 法效果好，说明煮沸法不适合玉米片、爆米花DNA 的提取。由图1 ～ 图4 来看，CTAB 有效改良法提取DNA 效果好，几乎无拖尾现象，而其他CTAB 法效果不好，说明原有的CTAB 法并不适合玉米片、爆米花DNA 提取，在方法上、试剂上都要有很大改进，如延长消化反应时间、提高提取缓冲液中NaCl含量等。

4.3.2 分光光度计结果讨论

玉米片：在所有方法中，CTAB 有效改良法提取的DNA 纯度比较好，其他方法提取出DNA 的OD 比值均小于1.6，说明有蛋白质、酚等污染，产物纯度不够。

爆米花：在所有方法中，CTAB 有效改良法提取的DNA 纯度最高，其他方法提取出DNA 的OD比值均小于1.6，说明有蛋白质、酚等污染，产物纯度不够。

5 结论

从试验结果来看，改良的CTAB 法能成功从玉米深加工产品玉米片、爆米花中提出DNA，经典CTAB 和初步改良CTAB 法效果都不如有效改良法好，煮沸法不适合玉米片和爆米花DNA 的提取。