2014-2020年宁夏沙门菌分子分型与耐药性研究

郭邦成，李 娜，张燕飞，魏 琼，刘 翔，郝 琼

沙门菌是一种人兽共患病病原菌，亦为食源性疾病暴发的主要病原菌，目前已发现血清型别多达2 700多种[1]，由沙门菌感染引起的患病人数呈快速上升趋势，WHO对沙门菌感染十分重视，早在2000年就成立世界范围的全球沙门菌监测系统[2]，宁夏疾病预防控制中心从2011年起加入食品安全风险监测项目，全面监测本地区食品及临床沙门菌的分布与传播，及对常用抗菌药物的耐药程度。本研究对2014-2020年分离自食品和病例中的188株沙门菌进行血清型、耐药性及PFGE分子分型，为深入了解宁夏地区不同来源沙门菌的耐药性及分子分型特点，用于指导临床合理用药和肠道传染病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集宁夏2014-2020年5个市级食品安全风险监测点和15家食源性疾病哨点医院188株沙门菌，生化鉴定、血清凝集复核后，进行PFGE分子分型和药物敏感性实验。

1.2 试剂与设备

1.2.1 试剂 选择性平板(麦康凯、XLD)等购自环凯生物公司；科玛嘉鉴定培养基购自法国 CHROMAgar 公司；药敏平板购自上海星佰科技生物有限公司；沙门氏菌诊断血清购自丹麦SSI公司；限制性内切酶XbaⅠ购自NEB公司；Seakem Glod琼脂糖购自美国LONZA公司；Tris-Hcl、SDS、EDTA等购自Souarbio Life scienses公司；

1.2.2 仪器 飞行质谱仪购自Bruker公司。凝胶成像仪及脉冲场凝胶电泳系统购自美国Bio-Rad公司。全自动药敏判读仪、加样仪购自上海星佰科技生物有限公司。

1.3 菌株复核 将监测点上送可疑沙门菌分离株划线接种MAC、XLD及科玛嘉显色培养基36 ℃培养18 h，挑取可疑菌落经飞行质谱仪鉴定，沙门氏菌血清分型。

1.4 药敏试验 采用微量肉汤稀释法测定抗生素的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)，具体按照上海星佰科技生物有限公司提供的操作步骤进行。

1.5 脉冲场凝胶电泳分型 按照国家致病菌识别网分型方案进行[3-5]。沙门菌经过包埋固定、裂解、洗涤后，采用XbaI酶切2.5 h，使用Chef Mapper脉冲场凝胶电泳分型，电泳时间为18 h，电泳温度为14 ℃，脉冲时间为2.16～63.8 s。凝胶使用GelRed染色后成像。

1.6 统计分析 使用BioNumerics软件处理PFGE成像谱图，采用基于条带比较的Dice系数衡量PFGE带型之间的相似度，相似度为100%被视为同一PFGE型。

2 结 果

2.1 血清型分布 2014-2020年共分离沙门菌188株，其中病人来源154株，占所有分离株的81.91%，经血清鉴定，共分属19个血清型，以肠炎沙门菌为主，占分离菌株的49.35%，其次为鼠伤寒沙氏菌，占22.08%；食品来源34株，分属7个血清型，肠炎沙门菌亦为主要型别，占52.94%，其次为沙门菌Ⅱ，占26.47%。无论是病例来源还是食品来源，血清型均表现为多样性，优势型别明显，具体结果见表1。

2.2 药物敏感性试验结果 188株沙门菌采用肉汤稀释法进行14种抗生素的药物敏感性试验，182株菌均出现不同程度的耐药和多重耐药。分离株对氨苄西林(AMP)、四环素(TET)、萘啶酸(NAL)、头孢唑林(CFZ)均呈现较高的耐药性。病例和食品来源菌株绝大多数出现2～12种抗生素耐药现象。152株病例来源菌株发现17个耐药谱，30株食品来源菌株发现6个耐药谱。不同来源菌株的优势耐药谱均为CHL-GEN-TET-CTX-AMP-CFZ-SXT(见表2、表3和表4)。

表2 不同来源沙门菌对14种抗生素耐药情况

表3 病例来源沙门菌耐药谱分布情况(n=30)

表4 食品来源沙门菌耐药谱分布情况(n=152)

2.3 脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型结果 188株不同来源分离株采用XbaI酶切后，共分为93个不同的PFGE带型，相似度为42.1%～97.1%，优势带型为NXSM0065型为15株，占7.99%；其次为NXSM0074和NXSM0069型各13株，分别占6.91%(见图1)。

图1 188株沙门菌PFGE聚类分析图谱

3 讨 论

近年来沙门菌在宁夏地区流行呈现以散发为主，部分地区时有小范围暴发。本研究对2014-2020年分离的188株沙门菌进行统计分析，多年来宁夏地区沙门菌流行特征未发生明显变化，分离株共分为19个血清型，病例和食品来源菌株血清型均表现为多样性，优势血清型明显，以肠炎沙门菌为主，其次为鼠伤寒沙门菌和沙门菌Ⅱ。与林茂锐等研究广东省以鼠伤寒沙门菌为主，其次为肠炎沙门菌不一致[1]。

抗生素滥用是造成病原菌耐药问题日益突出的主要原因[6-8]。从本研究结果来看，宁夏地区沙门菌耐药性十分严重，188株分离株仅有6株为敏感菌株，多数来源于食品，其余菌株均出现不同程度的耐药性。尤其对氨苄西林(AMP)、四环素(TET)、萘啶酸(NAL)、头孢唑林(CFZ)均呈现较高的耐药性。其多重耐药情况也非常严重，152株病例来源菌株发现17个耐药谱，耐2～4种抗生素77株(50.66%)， 耐5～8种抗生素50株(32.89%)，耐9～12种抗生素21株(13.82%)。30株食品来源菌株发现6个耐药谱，耐2～4种抗生素24株(80.00%)， 耐5～8种抗生素2株(6.67%)，耐9～12种抗生素2株(6.67%)。不同来源菌株的优势耐药谱均为CHL-GEN-TET-CTX-AMP-CFZ-SXT。从耐药谱来看，宁夏地区沙门菌对临床上应用逐步减少的氨苄西林(AMP)、四环素(TET)、萘啶酸(NAL)仍然呈现高耐药性，间接表明在动物养殖方面存在该类抗生素的滥用现象。同时头孢唑林(CFZ)、头孢噻肟(CTX)等临床一线抗生素亦呈现高耐药现象，从临床和公共卫生角度值得我们高度关注。

PFGE是近年来快速发展的传染性病原菌分子分型技术。依托这种技术和网络化实验室实时监测、交换和比对数据，可以及时发现、识别聚集性病例，为食源性传染病早期预测预警，暴发疫情与突发公共卫生事件的调查与现场处置提供了强有力的武器[9-10]。本研究利用该技术分析了宁夏沙门菌PFGE利指纹图谱”特征与优势带型，积累了分子流行病学基线数据；从分型结果来看，宁夏地区沙门菌无论病例来源还是食品来源，相同血清型菌株同源性较高，优势型别较为明显。耐药性和PFGE带型上没有体现出明显的关联性，同一耐药谱菌株PFGE型别呈现多样性，与林茂锐等对广东省沙门菌耐药性和分子分型研究结果相一致[1]。

利益冲突：无

引用本文格式：郭邦成，李 娜，张燕飞，等. 2014-2020年宁夏沙门菌分子分型与耐药性研究[J]. 中国人兽共患病学报，2022，38(2)：145-149. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.021