双重血浆分子吸附对百草枯中毒肝脏损伤的作用机制研究

兰薇 吕敏清 朱常青 张樱华

广州市第十二人民医院肾内科，广州 510620

百草枯致死剂量小，人体吸入后可迅速吸收于各大器官，对肝脏可造成不可逆的伤害，中毒后病死率极高［1］。组合式血液净化是目前常见的治疗方法，如血液灌流+血液滤过或滤过透析治疗，对患者中毒所致肝损现象起到一定的缓解效果，挽回部分患者生命，证实百草枯中毒患者使用组合式血液净化安全有效［2］。目前，在临床上应用双重血浆分子吸附系统治疗百草枯中毒致多脏器功能损伤的报道极少见。在本研究中，笔者采用双重血浆分子吸附系统治疗百草枯所致肝功能衰竭患者；一方面，探讨双重血浆分子吸附对百草枯中毒患者血清炎性因子、肝功能及免疫功能的影响；另一方面，探讨双重血浆分子吸附对百草枯中毒患者肝功能的保护作用，并探讨其保护作用机制是否与下调miR-155并激活Nrf2/HO-1信号通路有关，为开发相关药物防治百草枯所致肝功能损伤提供理论依据。

资料与方法

1、研究资料

对2020年6月至2021年6月广州市第十二人民医院急诊收治的40例急性百草枯中毒患者的临床治疗资料进行回顾性分析，将患者按不同血液净化方案分为观察组（20例）和对照组（20例）。观察组男14例，女6例，年龄21～73（36.7±13.8）岁；服毒量10～40 ml；中毒时间20 min～8 h。对照组男12例，女8例，年龄20～71（36.2±13.5）岁；服毒量10～40 ml；中毒时间20 min～8 h。研究对象或其亲属对本研究知情同意并签署知情同意书。纳入标准：⑴符合急性百草枯中毒诊断标准；⑵经口中毒，服毒量在50 ml内；⑶服毒到就医时间<8 h。排除标准：⑴患者及家属不同意血液净化治疗；⑵入院后48 h内死亡；⑶混合其他药物中毒者；⑷既往恶性肿瘤、心（脑）血管疾病、血液疾病、肾衰竭等恶性疾病者。

2、研究方法

2.1、观察组 在常规药物治疗的基础上采用双重血浆分子吸附系统治疗。采用双重血浆分子吸附系统治疗前静脉注射地塞米松（广州白云山天心制药股份有限公司，5 mg/支，针剂）5 mg防止过敏，开放体外股静脉通路，予肝素（华北制药股份有限公司，2 ml∶12 500 U，2 ml/支）100 mg及生理盐水3 000 ml行模型血浆分离器、血液灌注器、胆红素吸附器进行预冲洗，后将静脉回血端与血浆分离的出浆端接通。按照患者凝血功能进行肝素剂量调节，并参照压力监测情况适当追加肝素，确保患者全身肝素化。建立体外循环，静脉端采用鱼精蛋白（北京悦腹凯悦制药有限公司，5 ml∶50 mg，50 mg/支）中和，分离血浆，血液泵的初始速率控制在80～100 ml/min，5 min后将血浆泵速率调整为30～50 ml/min，并确保血液速率120～150 ml/min。血浆分离后采用DX350胆红素吸附柱实施吸附，再采用HA330-Ⅱ血液灌注器实施吸附，再经静脉端将其回输至患者机体内，血浆处理量为6 L，平均治疗时间为3 h，3～5次为1个疗程，2个疗程间隔3 d。

2.2、对照组 单纯使用血液灌流治疗，在常规药物治疗的基础上立即进行血液灌流治疗，采用一次性血液灌流器HA330（健帆公司），每天1次，每次灌流治疗约2 h，3次为1个疗程。两组均治疗2个疗程后对比观察指标变化情况。

3、观察指标

观察两组患者以下各指标入院8 h、治疗后第3天、或治疗后第6天的变化：炎症因子［白细胞介素（IL）-10、IL-17、转 化 生 长 因 子（TGF）-β、CRP、IL-6、肿 瘤 坏 死 因 子（TNF）-α］，肝功能［丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆红素（TBil）、直接胆红素（DBil）］，T淋巴细胞亚群（CD4+、CD8+），定血清miR-155、核因子E2相关因子2（Nrf2）及其下游基因GCLC、苯醌氧化还原酶（NQO1）和血红素氧化酶1（HO-1）。

4、统计学方法

使用SPSS 20.0软件，符合正态分布的计量资料采用（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，计数资料采用例（%）表示，采用x2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1、对患者血清炎性因子的影响

入院8 h，两组患者IL-10、IL-17、TGF-β、CRP、IL-6、TNF-α均高于正常值，且观察组显著低于对照组（均P<0.05）；治疗后第3、6天，两组IL-10、IL-17、TGF-β、CRP、IL-6、TNF-α水平均呈逐渐下降趋势，且观察组下降更为明显（均P<0.05）；见表1。

表1 两组百草枯中毒患者血清炎性因子的变化（±s）

表1 两组百草枯中毒患者血清炎性因子的变化（±s）

注：观察组（20例）在常规药物治疗的基础上采用双重血浆分子吸附系统治疗，对照组（20例）在常规药物治疗的基础上进行血液灌流治疗；IL-10为白细胞介素-10，IL-17为白细胞介素-17，TGF-β为转化生长因子-β，CRP为C反应蛋白，IL-6为白细胞介素-6，TNF-α为肿瘤坏死因子-α

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2、对百草枯中毒患者肝功能的保护作用

入院8 h后，两组患者ALT、TBil、DBil水平均高于正常值，且观察组则著低于对照组（均P<0.05）；治疗后第3、6天，两组ALT、TBil、DBil水平均呈逐渐下降趋势，且观察组下降更为明显（均P<0.05）；见表2。

表2 两组百草枯中毒患者肝功能指标的变化（±s）

表2 两组百草枯中毒患者肝功能指标的变化（±s）

注：观察组（20例）在常规药物治疗的基础上采用双重血浆分子吸附系统治疗，对照组（20例）在常规药物治疗的基础上进行血液灌流治疗；ALT为丙氨酸氨基转移酶，TBiL为总胆红素，DBil为直接胆红素

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3、T淋巴细胞亚群指标变化

入院8 h，两组CD4+、CD8+水平比较，差异均无统计学意义（均P>0.05）；治疗后第6天，两组CD4+、CD8+水平均低于入院8 h，组内比较（观察组t=6.816、5.517，均P<0.001；对照组t=2.415、2.069，P=0.020、0.045）；治疗后6 d，观察组CD4+、CD8+水平均低于对照组（均P<0.05）。见表3。

表3 两组百草枯中毒患者T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+指标的变化（%，±s）

表3 两组百草枯中毒患者T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+指标的变化（%，±s）

注：观察组（20例）在常规药物治疗的基础上采用双重血浆分子吸附系统治疗，对照组（20例）在常规药物治疗的基础上进行血液灌流治疗；CD4+为CD4+T淋巴细胞，CD8+为CD8+T淋巴细胞。

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4、两组Nrf2、miR-155、GCLC、HO-1、NQ01水平的变化

百草枯中毒肝脏损伤患者在入院8 h Nrf2、miR-155、HO-1、NQ01均处于高表达水平，治疗后第6天，两组miR-155明显低于入院8 h时（观察组t=18.109，P<0.001；对照组t=2.336，P=0.024），Nrf2与HO-1、NQ01则高于入院8 h时（观察组t=24.400、7.390、49.193，均P<0.001；对照组t=10.846、2.296、14.264，P<0.001、=0.027、<0.001）；治疗后第6天，观察组miR-155、Nrf2、HO-1、NQ01的表达均明显优于对照组（均P<0.05）。见表4。

表4 两组百草枯中毒患者Nrf2、miR-155、GCLC、HO-1、NQ01水平的变化（±s）

表4 两组百草枯中毒患者Nrf2、miR-155、GCLC、HO-1、NQ01水平的变化（±s）

注：观察组在常规药物治疗的基础上采用双重血浆分子吸附系统治疗，对照组在常规药物治疗的基础上进行血液灌流治疗；miR-155为miRNAs基因，Nrf2为核因子E2相关因子2，NQO1为苯醌氧化还原酶，HO-1为血红素氧化酶1

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讨 论

目前，临床上缺乏百草枯中毒特异性解毒药物，对百草枯中毒患者的治疗，以阻止毒物继续吸收并对已吸收毒物及时有效清除为救治关键，同时对各脏器损伤情况进行及时、积极的有效对症干预治疗，以期提高患者存活率［3-4］。早期血液净化是目前常用的有效清除患者血液中毒物的治疗手段，可将患者血液中百草枯成分迅速清除。其中血液灌流是目前公认有效的百草枯早期血液净化治疗手段，但单一的血液灌流易出现饱和现象［5］。近年有文献报道组合式血液净化取得了极好的治疗效果，即用血液灌流联合血液滤过或滤过透析等进行血液净化，其效果均优于单一手段的血液净化治疗，组合式血液净化在百草枯中毒救治中的有效性及安全性均得到了证实［6-7］。因此，充分利用现有的血液净化技术，根据各种技术的特点结合患者中毒剂量、时间以及患者中毒后各器官的功能状态等，选取合适的血液净化方式，对百草枯中毒患者来说极为重要。

肝脏是人体主要解毒器官，也是百草枯中毒损伤的主要靶器官之一。百草枯中毒可致患者肝脏出现组织淤血、炎症浸润及变性坏死，最终走向肝脏衰竭而亡，因此，百草枯所致的肝功能损伤也是PQ中毒患者高病死率的主要因素之一［8］。百草枯致肝损伤的机制目前尚未有明确结论，临床上则以中毒后机体氧化应激引发一系列反应，如促进炎性介质的表达等，是形成肝功能损伤的多数分子途径和发病机制的最终结果，从而导致肝脏出现不同程度的损伤［9-10］。因此，研究肝功能损伤中抗氧化的调节机制具有重要的作用。双重血浆分子吸附系统是近来临床研究的新热点，其为结合DX350胆红素吸附柱与HA330-Ⅱ血液灌流器的一种组合式血液净化手段，该技术在吸附胆红素、胆汁酸以及吸附炎性介质、IL-6及IL-10等中大分子毒素方面具有显著的特异性，能迅速有效清除胆红素及炎性介质等有害物质，减轻炎性反应，改善免疫反应，从而改善患者的肝脏功能。本次研究我们通过临床实践，探讨双重血浆分子吸附对百草枯中毒肝脏损伤患者血清炎性因子、肝功能、免疫功能等的影响。对患者血清炎性因子观察结果表明：入院8 h后，两组患者IL-10、IL-17、TGF-β、CRP、IL-6、TNF-α均高于正常值，说明百草枯人体吸收后可迅速发过脂质过氧化反应，组织细胞结构被破坏，机体即启动炎症应激反应，表现为炎性因子迅速大量释放。使用双重血浆分子吸附血液净化的观察组血清炎性因子表达在患者入院8 h及治疗后第3、6天均明显低于单纯使用血液灌流治疗的对照组（均P<0.05），两组T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+水平治疗后第6天均低于入院8 h时（均P<0.05），且观察组更为明显（均P<0.05）；说明双重血浆分子吸附清除百草枯成分更为快速，其特有的炎性介质吸附功能及胆红素等有害物质吸附功能，使胆红素、炎性介质等得以迅速有效地清除，使炎性因子生成大大减少，抑制氧化应激反应，使机体抗氧化能力得到增强，改善免疫反应，从而避免肝脏功能进一步受损。结果证实，使用双重血浆分子吸附治疗后观察组患者ALT、TBil、DBil水平均下降40%～45%，明显优于单纯血液灌流治疗的对照组（均P<0.05），说明双重血浆分子吸附在清除胆红素等有害物质方面效果更优，能更有效地减轻患者肝脏损伤现象，有效改善肝脏功能。

miR-155是一种重要的miRNAs，通过靶蛋白相关信号通路的一系列级联反应，影响细胞的生长、分化、凋亡等功能，可调节机体自身免疫反应、炎性反应、肿瘤与移植排斥及耐受等。百草枯中毒机体氧化应激反应时miR-155表达增加，引起肝脏细胞氧化应激、凋亡、氧化损伤并抑制Nrf2信号通路［11］。Nrf2可启动、调控下游如HO-1等基因的表达，HO-1是人体极其重要的抗氧化保护性蛋白，是机体典型的保护和防御体系。机体正常状态下Nrf2与胞浆蛋白伴侣分子（Keap l）结合处于抑制状态，在细胞中表达非常低，但当Nrf2受到刺激时，即迅速与Keap l解体并与抗氧化反应元件（ARE）结合，对下游基因如HO-1、NQ01等进行调控，从而保护机体抵抗内生性和外源性应激，增强机体抵抗力［12］。Nrf2通路可产生抗氧化、抗炎、减轻Ca2+超载等作用，在肝功能损伤中具有重要的作用。双重血浆分子吸附有效降低患者氧化应激，从而显著降低氧化应激引起的miR-155表达，从而激活Nrf2/HO-1信号通路，增强机体对外界刺激的抵抗力。本研究观察结果也证实，本组百草枯中毒肝脏损伤患者在入院8 h的Nrf2、miR-155均处于高表达水平，治疗后第6天，观察组miR-155显著低于入院8 h时（均P<0.05），Nrf2与HO-1、NQ01则显著高于入院8 h时（均P<0.05），观察组miR-155、Nrf2、HO-1、NQ01的表达均明显优于对照组，结合观察组治疗6 d肝功能显著优于对照组这一结果，说明双重血浆分子吸附对百草枯中毒患者肝功能的保护作用应与通过下调miR-155并激活Nrf2/HO-1信号通路相关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突