高效液相色谱法测定双组分体系设计性实验的教学实践

江玥曈，田 甜，杨 文，周婷婷，闻 俊△

(1海军军医大学药学系药物分析学教研室， 上海 200433；2上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室； △通讯作者)

生物药物分析是一门应用生物化学、微生物学、细胞生物学、免疫学、分子生物学、有机化学、分析化学、数学、生物工程等学科的理论及技术，检测和研究各种生物药物质量的综合性应用学科，旨在培养学生全面的生物药物质量意识和分析工作技能[1]。作为生物技术专业学生的一门专业课程，生物药物分析是一门实践性、应用性很强的方法学科。生物药物分析实验是其课程教学中不可缺少的重要组成部分，通过实验课可训练学生的基本操作技能，培养学生分析问题与解决问题的能力，为今后从事生物药物质量研究与控制工作打下坚实的基础。

生物医药的创新发展对本科人才的要求越来越高，传统的验证性为主的实验课已经不能满足人才培养的需要。多年实践教学的探索与改革，已经促使生物药物分析实验教学在验证性的基础上，开展综合性和设计性实验，形成多层次实验教学体系[2,3]。其中，设计性实验对学生的要求更高，不仅要求学生主动学习，独立思考，进行实验方案的设计，而且还要学会分析及解决实验过程中出现的各种问题，获得研究体验[4]。通过这种主动学习为主的设计性实验教学模式，学生提高了信息搜集、独立分析以及深入探究的能力，培养了严谨专业的生物药物分析思维，为今后生物制药等其他专业课的学习和工作中的应用打下坚实的基础。

在以往高效液相色谱法单组分定量实验的基础上，结合生物药物含量测定分析方法建立与验证的实验要求，实验教学选择双组分体系的复方制剂开展高效液相色谱法双组分体系含量测定设计性实验。该实验要求学生根据实验对象的特点，通过查阅文献和自主思考，设计双组分药物含量测定分析方法验证方案，在教师指导下，进一步开展实验研究，最终总结汇报后形成实验报告和研究论文。

1 实验选题与教学准备

在实验对象的选择上，教学组认为真实的临床使用药物更能激发学生的学习兴趣，因此双组分体系选择了临床用治疗痤疮、脂溢性皮炎的液体制剂，即复方氯霉素醇溶液[5]。复方氯霉素醇溶液含2%氯霉素和2%水杨酸，是一种组成简单、临床常用的液体试剂。氯霉素和水杨酸均具有较好的紫外吸收，都可以用反相液相色谱法进行分析。学生可以方便地查阅到相关文献资料，能够了解药物的背景知识和基本分析方法，从而设计出合理的含量测定实验方案。另外，液体试剂作为设计性实验对象，其处理方法相对简单，使得学生可以更多关注双组分的色谱分析要求及方法验证的内在逻辑。

双组分体系与单组分体系相比，难度在于氯霉素和水杨酸既要做到基线分离，又要满足测定灵敏度的要求，还需要尽可能地缩短分析周期。除此以外，如何规范使用高效液相色谱仪也是学生需要考虑的内容。这些对于教师的教学准备也提出了更高的要求。教师不仅需要从色谱分析方法建立和评价的角度进行方案修改，还需要对学生的基本操作步骤进行规范，确定学生每一个环节，无论是方法策略、还是实验技能，都做到严谨而规范的设计，才能达到高阶性的教学目标。

2 实验设计与方案确定

本次高效液相色谱法测定双组分体系设计性实验要求学生在文献调研的基础上，按照实验目的、药物及现有分析方法介绍、实验设计思路、仪器和试剂、实验步骤、设计讨论6个部分进行方案撰写[6]。教师提前2个月给学生布置本次实验的设计任务及要求，学生则利用课外时间进行文献资料查阅、调研和讨论。形成方案之后，学生与教师进行多次的沟通，一起探讨实验设计的可行性，并且阶段性地向教师提交实验设计方案。教师则对每一次学生提交的方案进行充分批改，并提出改进意见；学生再根据指出的问题进一步查阅文献或书本进行完善。

设计性实验的首要难度就是方案从无到有。因此，教学的关键是教会学生根据含量测定方法建立和评价的需求去查阅相关的书籍和文献，既要考虑药物的性质，又要理解高效液相色谱法的应用原理，实现二者的融合，而不是简单的模仿文献或教材中的内容。为此，引导式的教学显得尤为重要。教师的批改意见应是探讨方式，取代直接给出正确操作的做法。在修改方案的过程中，教师不应单纯指出学生方案的不正确或者不完善，而是指出问题所在，进一步用引导性的话语，指明可以参考的内容和思考的方向。

例如学生根据参考文献中的液相色谱条件拟定实验方案时，教师会询问“选择液相色谱条件时应主要考虑哪些方面的影响”，提醒同学们可结合反相色谱洗脱规律考虑不同色谱条件对色谱峰峰位、峰形的影响，列出方法建立过程中的应对措施。学生在撰写准确度验证步骤时，经常会出现加样回收实验中设计的对照品浓度梯度不合理。教师则会要求学生参考《中国药典》四部的分析方法验证指导原则，在仔细阅读理解、并结合参考文献的基础上，根据供试品的浓度进行对照品加入量的选择。在教师的提示下，学生会根据具体的要求，设计对照品与供试品1∶1的加入，或者是0.8∶1，1∶1，1.2∶1的三个浓度加入。这些互动的过程不是简单的公布答案，而是教会学生如何将液相色谱定量分析的基本理论和解决实际问题联系起来，如何将分析方法验证的指导原则和含量测定方法评价联系起来，让学生在巩固理论知识的基础上，去进一步完善实验设计方案，从而达到运用药物分析的理论知识科学地解决药物质量控制中实际问题的能力培养。在引导、帮助学生分析归纳的过程中，使他们认识到理论与实际之间的距离，从而激发了自主研究的学习兴趣，也提升了独立分析问题、解决问题的能力。

尽管设计性实验中实验设计思想很关键，但实验设计思想要通过具体的实验步骤去实现，而每一个实验步骤中都渗透着实验设计思想。因此，教师在指导学生设计实验时不应只注重学生实验设计思想上的优劣，而是应同时关注其实验步骤的设计是否合理、可靠、具有操作性。

3 方案实施与结果评价

学生通过对实验设计方案的多次修改与完善，基本形成了生物药物含量测定方法建立与评价的研究思路，突破了原有理论学习中固化的思维方式，以实践为最终任务，认识到生物药物分析课程的实践性特点，训练了生物药物分析的专业思维能力。

在最终的实验方案确定后，学生以小组为单位在实验课时内对双组分体系复方氯霉素醇溶液进行高效液相色谱法的含量测定。实验过程近似于研究过程，会出现学生方案中未能完善的内容。我们要求学生能够根据实验进行程度作出有序的调整。例如高效液相色谱仪的准备，对照品和供试品称量选用的天平精度，加样回收率对线性范围的要求等，均需要学生能够及时处置以获得正确的数据。如果因处置不及时出现的问题，学生则需要进行及时的补救。尽管实验过程的反复会造成学生的疲惫，但是此刻教师应帮助学生找出问题的原因，并且积极鼓励学生、引导学生给出正确的方案调整，陪同学生解决实验中的问题，让学生体会团队合作的重要性。

我们在实验结束后单独设置一节结题汇报课程。每组学生以电子幻灯报告的形式将实验方案、实施过程、数据结果等进行汇报，并对整个设计性实验过程进行分析和反思。这种集体汇报的形式，促进了学生之间的交流与讨论，通过聆听、比较本组与其他组的实验内容，找到自身的不足和优势，总结出生物药物含量测定方法建立和评价的一般流程与实验思路。因此，设计性实验的成绩评价应该体现综合性，包括实验设计方案初稿、修改稿、最终实验方案以及实验实施、数据处理和结题汇报；既考虑不同学生理论学习基础上的差异，又充分考虑到在实验设计过程中学生学习主动性、积极性的表现，以及在此过程中学生学习能力、探索能力、表达能力等综合能力的提高程度，从而更加全面准确地评价学生对知识的掌握、理解和运用情况。

4 学生反馈与今后改进

学生对此种形式的实验教学给予了肯定，表达了从设计性实验中理解知识、运用知识、形成思维的重要性，也对实验教学本身给出了自己的感受。首先，学生对设计性实验教学预期不足，无法对获得资料进行有效处理，导致实验方案修改多次，需要注意的关键知识点越来越多，自己知识的缺口也越来越大，比传统实验难度大。其次，学生对引导性方案修改不适应，导致对实验成功的信心降低。学生希望指导教师给出“标准答案”而非“提示问题”，认为直接获得答案更有利于实验顺利开展，却忽略了实验设计思维的锻炼。第三，学生对理论知识掌握不够牢固，实验设计中出现非常明显的错误却不能发现。理论的清晰掌握是设计性实验顺利开展的保证，然而由于理论教学后未及时复习，造成实验设计方案不够规范，整理思路上出现明显偏差。但是在与指导教师多次磨合之后，学生适应了自主学习和引导式方案修改，使问题得到了逐一解决，又会感到轻松。而这种轻松的背后是理论知识实现实际应用的过程。

因此在今后的设计性实验教学中，教师要注意学生知识上的偏差，实现有效的引导式教学，具体包括：①教师将设计性实验教学任务分解清晰，提出高效液相色谱法分析复方氯霉素醇溶液的关键点有色谱分析方法建立、色谱系统适用性评价，方法验证关键点有专属性和耐用性、线性和范围、精密度和准确度；②教师指导学生查阅文献寻找有效信息，提出该设计性实验主要关键词包括高效液相色谱法、氯霉素、水杨酸、方法学验证等，按照上述要求查阅单组分的色谱条件，在分析其基础上拟定方案；③教师以面对面讨论代替部分书面修改，给予学生直接的学习帮助，降低学生焦虑感；④教师理论教学后布置相关文献分析作业，先通过“纸上谈兵”强化学生对方法建立和评价的知识理解，再进行方案设计，获得有效的能力提升。

总之，在高效液相色谱法测定双组分体系设计性实验的课程实施中，我们以问题为导向，引导学生自主设计实验方案，培养学生信息搜集、独立分析以及深入探究的能力，在体验研究式学习的过程中，逐渐形成了严谨专业的生物药物分析思维。