中草药中黄酮类化合物含量的测定方法研究进展

杨慧，杨天润，马子雲

(河北大学基础医学院，河北 保定 071000)

黄酮类化合物是由两个苯环通过三个碳原子相互连接而成的一系列化合物的总称，具有C6-C3-C6结构。该类化合物广泛存在于自然界，在植物中含量丰富，较易获得。同时，黄酮类化合物具有广泛的药理活性，如抗氧化和清除自由基、抗感染、抗肿瘤、改善微循环等作用，在诸多疾病的临床治疗中效果显著[1]。黄酮类化合物是很多中草药中的有效活性成分，由于中药成分复杂，含量测定时易受干扰，因而建立科学有效的测定方法对于中药药品质量控制和药理作用研究至关重要。现就黄酮类化合物含量测定方法作一综述，为进一步研究提供参考。

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1 高效液相色谱法

高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)是一种具有分析速度快、检测灵敏度高、分离效率高、应用范围广、操作方便、重现性高等诸多特点的成分含量测定方法，是目前控制中药制剂有效成分的重要手段[2]。吕琳等[3]分离出桑寄生中的黄酮类化合物，应用HPLC法分别测定其中槲皮素和槲皮苷含量。槲皮素测定条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水-冰醋酸(45∶55∶1.5)为流动相，检测波长为370 nm。槲皮苷测定条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-水-磷酸(14∶86∶0.2)为流动相，检测波长为256 nm。结果显示，在一定范围内，两种物质浓度与峰面积呈良好线性关系，且精密度、稳定性、重复性等均符合标准。张云丽等[4]采用Fortis C18色谱柱(4.0 mm×150 mm，2.5μm)，流动相为甲醇∶乙腈∶0.2%磷酸水缓冲溶液系统，梯度洗脱，柱温为 28 ℃，检测波长为225 nm，测定半枝莲提取物中黄酮类成分野黄芩苷、木犀草素的含量。测定过程中采取梯度洗脱的方法，使两种成分的色谱峰得到较好分离，并具有合适的保留时间，测定结果更准确。张宪等[5]用该方法测定了不同产地桑叶中6种黄酮类成分的含量，并进行精密度、稳定性、重复性和加样回收率试验。精密度试验、稳定性试验检测色谱峰面积的相对标准偏差均低于1%，表明检测仪器与操作符合精密度的要求。结果显示，不同产地桑叶中6种黄酮类成分的含量差异较大，提示不同产地桑叶中黄酮的含量有差异，且HPLC测定桑叶中黄酮类成分的含量操作简便、稳定性及重复性较好。该结果为桑叶中黄酮类成分的后续研究提供了支持，也为比较不同产地中药材有效成分含量差异和选择药用植物生长的适宜条件提供了思路。

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此外，HPLC法在中药复方制剂的有效成分分离测定中也得到了广泛应用。徐占方等[6]建立了同时测定双黄消炎片中黄芩苷和黄芩素含量的反相高效液相色谱法；顾英琳等[7]采用高效液相色谱-二极管阵列检测器建立了同时测定苍耳子鼻炎胶囊中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素4个成分含量的方法；王晓月等[8]同时测定了黄芩射干汤中射干苷、野鸢尾苷、黄芩苷、汉黄芩苷、鸢尾黄素、黄芩素、次野鸢尾黄素、千层纸素A等8种有效成分含量；孔艳娥等[9]对胃病丸中8种有效成分——连翘酯苷A、橙皮苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、和厚朴酚、厚朴酚的含量进行了测定。

比色法在紫外-可见分光光度法的基础上，在待测物质溶液中加入显色剂，将其最大吸收波长控制在可见光区域，利用分光光度计测定物质含量。王嘉琛等[16]以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH为显色体系,测定中药墓头回中总黄酮的含量，并以吸光度为指标，对影响墓头回中总黄酮测定的反应温度、显色时间、显色剂用量进行考察，通过正交实验，确定了最佳显色方式。刁海鹏等[17]在NaNO2-AlCl3-NaOH显色条件下测定了蒲公英花中总黄酮的含量。龚受基等[18]也使用该显色方法测定了大田基黄中总黄酮含量，并对其提取物在抗乙肝病毒中的作用进行研究。龙跃等[19]对AlCl3比色法的显色条件进行了优化实验，确定了AlCl3比色法测定中草药中总黄酮含量的最优条件，在pH为5.2的NaAc-HAc缓冲溶液条件下，加入AlCl3，对雀儿舌头中总黄酮含量进行了测定，溶液体系在室温下稳定性良好，60 min内吸光度几无变化。热毛先等[20]对比研究了紫外直接测定法、AlCl3显色法、NaNO2显色法和HCl-Mg显色法在甘青青兰总黄酮测定时的应用，确定HCl-Mg显色法测定更准确，对黄酮类化合物具有很强的专属性，优于其他方法。

2 分光光度法

当黄酮分子中具有3-羟基(5-羟基)时，可与 Al3+、铍等离子形成一种稳定的荧光络合物，即为荧光光度测定黄酮类化合物的基础[21]。吴水华[22]选用槲皮素作为对照品，采用荧光法对福建野生金线莲中的总黄酮含量进行测定，测定结果准确、灵敏。黄肖桢等[23]用此法测定银杏叶提取物中总黄酮含量，实验结果表明，所采用的方法操作简便，检测高效快速，结果准确，数据重现性良好，适合用于银杏叶提取物中总黄酮含量的测定。李祥昀等[24]改进测定过程中的荧光条件，建立了一种简便、快捷定量检测黄芩中黄芩苷的新方法。该方法依据黄芩苷的抗氧化性和4，4’-二叠氮二苯乙烯-2，2’-二磺酸二钠四水合物(DES)还原产物的荧光特性，利用黄芩苷可将DES中的叠氮基团还原为氨基这一反应，通过检测 DES 还原产物的荧光信号强度，确定黄芩提取液中黄芩苷的含量。这种黄芩苷测定方法，具有良好的抗干扰性、稳定性和可重复性。

近年来，随着仪器制造水平的提升，各类辅助分析技术的丰富，近红外光谱技术得到了快速发展，并广泛应用于科研及生产过程，应用范围涉及农业、化工、食品、医药等诸多领域[25]。Shi等[26]利用近红外光谱法快速、无损地测定银杏叶中总黄酮含量，并以总黄酮含量为指标，对不同颜色银杏叶进行了质量评价。阿依古丽·塔什波拉提等[27]应用近红外光谱技术开展罗布麻叶中总黄酮无损快速检测方法研究，采用近红外光谱分析技术获取罗布麻叶的光谱信息，建立罗布麻叶中总黄酮含量的近红外定量分析校正模型，可在 30 s内对未知罗布麻叶中总黄酮含量进行无损检测。近红外光谱法的应用优势主要在于对中药样品的无损检测，样品可不经提取分离，只需简单粉碎便可进行测定，避免了测定过程中有效成分结构的破坏，也减少了提取时化学试剂的使用和药品的浪费。同时，近红外光谱技术与化学计量学方法相结合，可建立起定量分析模型，实现快速准确测定。

2.1 紫外-可见分光光度法

韩秋伟[11]和郧海丽等[12]分别利用紫外-可见分光光度法测定了双黄连颗粒和小儿清热宁颗粒中黄芩苷的含量，并与HPLC法相比较，测得数据准确可靠。任强等[13]用紫外-可见分光光度法测定了不同产地半枝莲中总黄酮的含量，通过回收率实验，证明该方法准确度较高。然而，紫外-可见分光光度法吸收光谱特征性不强、分离度较差，且中草药成分复杂，各物质结构上存在相似性，某一种物质含量的测定结果往往会受到其他成分的干扰，因而该方法在实际使用中得到了一定改进。彭易兰等[14]采用紫外-可见分光光度法测定黄芩黄酮总苷元提取物中总黄酮，用HPLC法测定其中黄芩素、汉黄芩素和千层纸素A的含量。蔡朝红等[15]以黄芩苷为标样，采用紫外双波长分光光度法，分别以289 nm 和 353 nm作为测定波长和参比波长，测定了黄连解毒汤中黄芩苷含量。在该实验中，样品可不经分离稀释后直接测定，操作简便，避免了各组分之间的相互影响。

2.2 比色法

HPLC法广泛应用于中草药中有效成分的含量测定，尤其是在多组分同时测定中起到了重要作用。在上述研究中，各成分均得到了良好的分离效果，测定结果准确度高、重复性好、操作简便。

对照组采用常规西医治疗方法,实验组则采用中西医结合方法。对两组患者的治疗效果进行比较。实验组的治疗总有效率为97.62%,而对照组的总有效率为76.75%。实验组的治疗效果显著于对照组。并且,两组患者在接受治疗后,实验组的抗卵巢抗体、抗精子抗体和抗子宫内膜抗体的转阴率均高于对照组,其中,两组数据均P<0.05,差异具有统计学意义。结果表明:中西医结合方法在治疗免疫性不孕不育中的临床应用效果显著。

2.3 荧光分光光度法

分光光度法是利用物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，以朗伯-比尔定律为理论基础，建立起来的对物质进行定性和定量分析的仪器分析方法。作为一种目前应用较多的食品药品分析方法，其灵敏度高、准确度较高、操作简便。现有的研究成果中，分光光度法可应用于食品中营养物质、重金属含量、农药残留情况以及食品添加剂的测定。同时，该方法在药品有效成分的定性与定量分析中也占据重要地位[10]。

2.4 近红外光谱法

11月26日下午至27日，浙江省自然资源厅执法监察局在杭州组织召开了2018年全省国土资源执法案卷质量评查工作会议。会议汇报交流了案卷质量评查工作开展情况和2018年工作思路，对全省各地上报的2018年度参评案卷质量集中评查。浙江省自然资源厅相关处室负责人，各设区市和有关县（市、区）执法监察系统负责人参加了会议。

3 多方法联合测定

由于单一检测方法具有一定局限性，加之各技术在中药成分分离测定中的应用日益广泛，一些联合测定方法逐渐被应用于中药黄酮类化合物的测定。如液相色谱-质谱联用技术集液相色谱高分离能力和质谱的结构解析能力于一体，具有高灵敏度、高分辨率、快速、稳定等特点，是黄酮类等复杂化合物同时定性定量分析的重要技术手段[28]。Li等[29]采用液相色谱-质谱联用法建立了同时测定竹叶中10种主要功能性黄酮类化合物的分析方法，校准曲线的相关系数为0.999 5～0.999 7，检测线为45 ng/mL。段云[30]利用超高液相色谱-串联质谱法同时测定了黄芩提取物中黄芩素、黄芩苷、汉黄芩苷、野黄芩苷等4种黄酮类成分的含量，检出限为0.3～1.5 μg/kg，灵敏度较高。Hadi等[31]将薄层色谱和紫外-可见分光光度法联合，对黄秋葵果实中黄酮化合物进行定性分析和含量测定，这种方法相较于单一的紫外-可见分光光度法更准确。此外，高效液相色谱-二极管阵列检测-蒸发光散射检测法、超高效液相色谱-电喷雾质谱联法、红外光谱三级鉴别法联合高效液相色谱-质谱法[32-34]在中药黄酮类化合物的分析与测定中均有应用。

作为中国宝贵的药用资源，中草药的研究和应用在传统医学与现代医学中均占据重要地位。中药有效成分的提取、分离、鉴定及药理作用是近年来国内研究的热点，但由于中药成分复杂，有效成分及作用机制难以解析，因此对中草药有效成分进行分离分析，明确所含成分及含量对药品质量控制及作用机理研究具有重要意义。在有效成分的含量测定方面，诸多方法各具优势，如紫外分光光度法操作简便、经济实用，适用于植物中总黄酮含量的粗略测定；HPLC可将各成分进行分离测定，目前应用较多。同时，随着原有技术的不断改进和化学计量学方法的结合，逐步建立起更多的测定方法，测定精度增高、测定时间缩短、操作程序简化、资源节约、污染减少是测定方法发展的必然趋势，未来必将有更多优良方案供研究者选择，以满足不同的测定需求。