沙棘叶乙酸乙酯萃取物对链脲佐菌素诱导的2型糖尿病小鼠肾脏的保护作用

杨 阳，韩智良，王润梅，乔越妍

（山西大同大学生命科学学院，山西大同 037009)

沙棘（拉丁学名：Hippophae rhamnoides Linn.）作为药食同源的植物，是民间常用的做饮料和酒的原料。沙棘含有机酸、丰富的维生素、花青素等多种生物活性物质[1-3]，具有养胃、清除自由基、延缓衰老、降低心脑血管疾病的发病率、提高耐缺氧能力、降低血清胆固醇、促进伤口修复等作用[4-5]。

糖尿病性肾病是糖尿病患者的并发症，其发生原因包括遗传因素、长期高血糖等[6]。实验研究了沙棘叶乙酸乙酯（ethyl acetate，EA）萃取物对链脲佐菌素诱导的2型糖尿病小鼠肾脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用的材料见表1。

表1 实验仪器与公司

1.2 动物造模及分组

5周龄SPF 级雄性C57BL/6小鼠通过高糖高脂肪饲料喂养，适应性饲养3～4 周后，然后全部禁食不禁水12 h，从中随机选取8 只腹腔注射生理盐水作为正常组，其余小鼠腹腔注射STZ（20 mg/kg）的剂量造模。之后正常饲喂1 周后，尾部采血，空腹血糖≥9 mmol/L 为建模成功。

动物实验遵循山西大同大学动物实验伦理委员会的认定，编号：2019001。

实验小鼠随机分成6 组，每组8 只，分组及灌胃给药情况如下：

低剂量给药组（EA 0.8）：造模成功的糖尿病小鼠，灌胃0.8 mg/kg EA。

中剂量给药组（EA 4）：造模成功的糖尿病小鼠，灌胃4 mg/kg EA。

高剂量给药组（EA 20）：造模成功的糖尿病小鼠，灌胃20 mg/kg EA

模型对照组（STZ:diabetic mice）：造模成功的糖尿病小鼠，灌胃等量生理盐水

正常对照组（Normal Control Group，NC）：正常饲养，未进行造模的小鼠，灌胃等量生理盐水。

阳性对照组（Positive control group，PC）：造模成功的糖尿病小鼠，灌胃糖尿病治疗药物，300 mg/kg。

1.3 实验方法

1.3.1 记录小鼠生理状态指标

记录每组小鼠日常饮食、饮水量、排尿量和实验期间的体重，以及精神状况、体态、死亡情况等并进行评价。

1.3.2 空腹血糖的测定

空腹12h后通过小鼠尾尖取测定血糖。

1.3.3 生化检测

用试剂盒检测各组小鼠GSH、MDA、SOD 的肾氧化应激指标，TNF-α level 的数值，BUN、Cre、Alb 等肾功能指标。

1.3.4 统计与分析

通过SPSS19.0 对所得实验数据进行分析。两组资料比较采用独立样本t检验，多组资料比较采用单因素方差分析，以P=0.05为检验水准。

2 结果与分析

2.1 各组小鼠空腹血糖数值

与NC 相比较，其他组血糖升高（P＜0.01），且相差不大。从第4 周开始，PC 与EA 组血糖逐渐降低。与STZ组相比，PC 与EA 组血糖水平较低（P＜0.05），说明EA 有降血糖的作用，且EA 各组的血糖水平随剂量增高降低，说明呈剂量依赖性。见图1。

图1 各组小鼠血糖的变化

2.2 各组小鼠TNF-α level的数值

图2显示：与正常组相比，NC组的TNF-α水平显着升高（P＜0.05）；阳性对照的TNF-α 水平降低很多，但高于正常组（P＜0.05）；EA组（20 mg/kg）较阳性组明显降低（P＜0.01）。

图2 小鼠肾肿瘤坏死因子

2.3 各组小鼠BUN、Cre、Alb的肾功能指标

表2 结果显示，阳性对照组与与STZ 组差异性显著，NC 组的各个指标差异性不大。EA 组的Alb 水平介于STZ 组与PC 组之间，且随剂量增大EA 组Alb 水平增高。EA 组的BUN 和Cre 同Alb 一样介于STZ 与PC 组之间，但随剂量增大EA 组BUN 和Cre 水平降低。这表明EA 可以减轻模型大鼠的肾脏损害，且呈剂量依赖性。

表2 小鼠肾功能的变化

2.4 各组小鼠GSH、MDA、SOD的肾氧化应激指标

由表3 可知，阳相对照组与NC 组的各个指标差异性不大，与STZ 组差异性显著。而EA(4、20 mg/kg)组的GSH，SOD水平高于阳性对照组。EA(4.20 mg/kg)组的MDA 水平低于阳性对照组。随剂量增大，EA 组GSH、SOD 增大MDA 减小。这表明EA 对肾氧化应激有保护作用，且呈剂量依赖性。

表3 小鼠肾氧化应激的变化

3 讨论

各种氧化应激指标可以代表肾脏活性氧水平与抗氧化能力是否平衡，如果肾脏受到有害刺激，抗氧化能力不足，自由基就会产生毒性，导致肾脏损伤[7]。EA 组的MDA 水平比糖尿病小鼠低，而MDA 是因为肾脏清除自由基能力受到损伤导致大量自由基反应生成的产物，它会使蛋白质、核酸失去功能，引起细胞毒性。实验中EA 组的SOD 水平比糖尿病小鼠高。SOD 是一种能够清除自由基的酶，与MDA 的作用相反，它会降低细胞毒性[8]。EA 组的GSH 水平比糖尿病小鼠高，GSH 能够保护细胞不被自由基损伤与它结构中的巯基有关，所以GSH 含量是一种检测氧化应激的指标[9]。可见乙酸乙酯萃取物有改善氧化应激的作用。

肾组织中肾小球的变化会影响肾功能，而Cre 是肾小球滤过功能的指标之一。Cre 浓度超过正常值说明肾小球的滤过功能损坏。BUN 和Cre 一样，其能够反应肾功能变化的原因是肾滤过功能出现故障时它就不能从机体中排出[10]。肾小球滤过功能的结构基础是滤过膜的通透性，Alb 由于电荷屏障不能通过肾小球滤膜，实验中检测Alb 指标则是由于滤过膜孔径小导致不能排出，但如果肾功能出现障碍，滤过膜不带负电荷，会使大量蛋白流出，形成蛋白尿。由本实验结果可知，EA 组较模型组的BUN、Cre 水平低，Alb 变高。说明乙酸乙酯萃取物对改善肾功能有积极作用。

与肾病相关的标志物还有炎症因子TNF-α。炎症因子在肾脏病中的数值明显高于正常，并且由于它是机体炎症与免疫应答的重要调节因子，所以它的数值很重要。TNF-α 可与受体结合，各种与炎症相关因子的表达导致某些机制启动，肾脏出现了大量的吞噬细胞，并产生大量TNF-α 加重病情[11-12]。EA 组相较于STZ 组的TNF-α 水平低，说明乙酸乙酯萃取物有减少炎症反应的作用。

糖尿病肾病不像其他疾病可以根治，它只能依靠药物来维持稳定。此实验研究的是沙棘叶对并发症肾病的治疗效果，对糖尿病类药物的发展有一定的贡献。