黄芪丹参对妊娠高血压大鼠胎盘VEGF、TNF-α表达的影响

李 敏，田 颖，都 燕，潘银平

(1.西北妇女儿童医院 产科，陕西 西安 710000;2.延安大学附属医院 产科,陕西 延安 716000)

妊娠期高血压疾病( Hypertension disorder complicating pregnangcy,HDCP)是妊娠过程中特有的疾病，主要的病理变化为血小管引发的全身性痉挛及身体里各个系统和器官的血流灌注减少，严重威胁母婴健康，甚至威胁母婴的生命[1]。妊娠高血压疾病一般好发于妊娠20周孕妇，常见的体征为血压升高和蛋白尿，严重者会导致孕妇发生胎盘卒中、早剥等并发症[2-3]。丹参具有扩张冠状动脉，抑制血小板聚集，改善微循环，增加组织供血供氧的作用。黄芪具有扩张血管，降低血压，增加红细胞的携氧能力及抗自由基的作用。中医认为妊娠高血压属于“血瘀”范畴，丹参可活血化瘀，黄芪可益气利水，二者联合使用可达到益气活血的效果。有研究显示肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor α，TNF-α)和血管内皮因子血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在浸润滋养细胞的同时，还有效的促进了胎盘的形成[4-5]。TNF-α在妊娠高血压疾病的发生机制中作为一种重要的介质而存在。也有学者发现，TNF-α可诱导血管内皮细胞从而产生前列腺素等，导致血管发生收缩，血压升高，同时发现TNF-α可直接导致血管内皮细胞的损伤[6]。VEGF是一种对血管内皮细胞有高效特异促有丝分裂因子，VEGF与其特异性受体结合发挥相应的生物学功能，对着床、胎盘血管形成有重要作用。研究发现，VEGF还能通过刺激滋养细胞MMP-9的活性，调节滋养细胞的侵袭能力，从而影响母体胎盘循环构建。随着对妊娠高血压疾病发病机理的深入研究，人们已经发现全身血管内皮细胞广泛损伤、胎盘脱模部位血管发育不良是妊娠期高血压疾病的基本病理改变，但血管内皮细胞损伤机理尚未完全阐明。有学者推测TNF-α和VEGF的异常表达与妊娠高血压疾病的发生及发展有密切的关系所以本文采用黄芪丹参对妊娠高血压大鼠进行干预治疗，并对其胎盘中的VEGF和TNF水平的表达进行研究，为妊娠高血压在临床上的治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验选用的30只雌性Wistar大鼠，SPF级，均是来自中国医学科学院上海实验动物中心。大鼠体重在200～250 g之间，常温下饲养大鼠，大鼠自由饮水摄食1周，让所有大鼠对新的环境进行适应。

1.2 试剂与仪器 本实验所有试剂和仪器分别来自由湖南中医学院药学院制备的黄芪丹参注射液，黄芪提取黄芪总皂甙、总黄酮；丹参提取丹参酮、丹参醌、丹参酚酸。全部经过灭菌和过滤后，冷藏备用。美国Cell Signaling Technology公司生产的VEGF抗体；武汉博士德公司生产的TNF-α抗体；北京中杉金桥生物技术有限公司生产的APES、DAB试剂盒；美国Sigma公司生产的STZ、PDTC；成都泰盟有限公司生产的BP-600A型大鼠无创血压测量仪；苏净安泰公司生产的超净工作台；0lympus日本生产的倒置光显微镜；瑞典Bromma公司生产的LKB—V型超薄切片机。

1.3 动物分组与模型建立 选用Wistar健康雌性成年大鼠32只，让大鼠适应1周新环境，测定大鼠血压，剔除稳定时尾压>150 mmHg的大鼠，剩余30只大鼠的阴道脱落细胞做成涂片。用每天的阴道脱落细胞对大鼠的动情期进行确定，并且让雌性大鼠和相同种系且均无高血压的雄性Wistar大鼠进行合笼，大鼠1∶1进行交配，第2天对大鼠进行观察，如果大鼠出现阴衰的情况，则认为是妊娠0 d的大鼠，并且对大鼠的孕期认真的进行标记。将妊娠大鼠平均分为3组：空白对照组(NC组)、妊娠高血压大鼠模型组(HDCP组)和妊娠高血压大鼠模型加黄芪丹参治疗组(HQ组)，每组10只。HDCP组和HQ组大鼠在妊娠第12天起皮下注射L-NAME，每日一次，注射量为125 mg(Kg.d)，NC组大鼠在妊娠第12天开始皮下注射生理盐水，注射量同HDCP组和HQ组大鼠相同。3组大鼠均注射干预到妊娠第21天。分别于妊娠12、16、17、21 d时测量3组大鼠的动脉收缩压和尿蛋白含量。以大鼠稳定时尾压>150 mmHg为造模成功。HQ组在妊娠第16天开始腹腔注射黄芪丹参注射液，1d注射1次，每次注射计量为250 mg/kg，连续注射至妊娠第18天。NC组和HDCP组大鼠均腹腔注射生理盐水，给药剂量和时间同HQ组大鼠相同。

1.4 标本采集 在大鼠妊娠12 d时收集大鼠的24 h尿量，并对尿量进行检测。在大鼠分娩前，分2次抽取大鼠尾部静脉血2 mL并放置离心管中，把分离的血清置入-20℃的环境中保存备用。当大鼠胎盘娩出后，取出胎盘中央位置没有出现明显出血的钙化处的组织，切成1 cm3的块状，生理盐水冲洗后固定，取上清液后，在-20℃的环境中保存待用。

1.5 血压和24 h尿蛋白测量 在妊娠第12、16、17、21天，把所有大鼠放置在预热箱内，对大鼠预热5 min，等到所有大鼠都平静后，对大鼠的尾静脉压进行测量，连续重复10次，最后取所有结果的平均值。在妊娠第12天开始测量大鼠的尿液，测量期间所有大鼠禁食，但正常饮水，用BCA法测定，步骤严格按照说明书执行。

1.6 胎盘组织形态学观察 麻醉所有大鼠后并处死大鼠，打开大鼠腹部，把胎盘组织取出后固定，石蜡包埋后切片，石蜡切片的厚度为4 μm，脱蜡后进行HE染色并进行观察。

1.7 测定血清中VEGF和TNF-α的含量 取3组大鼠离心后的血清，分别对大鼠血清中VEGF和TNF-α的含量进行测定。血清中VEGF的测定采用ELISA方法，经全自动酶免仪测定；TNF-α含量采用放射免疫分析法进行测定，所有操作严格按照试剂盒标准进行。

1.8 Western blot检测大鼠胎盘组织中VEGF和TNF-α蛋白的表达 将3组大鼠的胎盘组织分别提取100 mg，将细胞进行裂解并提取核蛋白，并对核蛋白的浓度进行测量，分装后，保存在零下20摄氏度的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混均，按照4∶1的比例进行，为了让蛋白质变性需将蛋白溶液全部进行煮沸处置。电泳板孔内注入蛋白样品50 μg。转至PVDF膜上后，把脱脂奶粉加入其中进行封闭，时常为1 h。根据Marker剪下相应区域的PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭，室温摇床孵育2 h；将稀释好的一抗BDNF、SYN分别加入，4℃环境孵育过夜；洗涤PVDF膜。分别将PVDF膜置二抗封闭液中，室温摇床下孵育1 h；再次洗涤PVDF膜。将PVDF膜在滤纸上控干，用ECL显色试剂盒显色；在UPVINC凝胶成像系统显影，扫描胶片，并用Image J软件测量各条带灰度值。以GAPDH为内参，以目的蛋白与内参灰度比值表示目的蛋白相对表达量。取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3，DAB显色后数码相机照相。

2 结果

2.1 3组大鼠不同妊娠时间不同时间血压情况 在妊娠第12天时，3组大鼠的血压比较没有明显的差异；在妊娠第16、17、21天时，与NC组相比，HDCP组大鼠的血压情况明显上升(P<0.05)；HQ组大鼠的血压情况明显比HDCP组大鼠下降(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠妊娠不同时间血压比较

2.2 3组大鼠不同时间24 h尿蛋白比较 在妊娠12天时，3组大鼠24 h尿蛋白的含量没有明显的差异(P>0.05)；在妊娠第16、17、21天时，HDCP组大鼠的尿蛋白含量显著比NC组增多(P<0.05)；经过黄芪丹参治疗后HQ组大鼠的尿蛋白含量明显降低(P<0.05，见表2)。

表2 3组大鼠不同时间24 h尿蛋白含量比较

2.3 3组大鼠胎盘组织形态比较 和NC组大鼠相比，HDCP组大鼠胎盘组织中的绒毛数量明显减少，并且结构出现萎缩，部分绒毛纤维素样坏死，滋养层细胞代偿性增值，出现较多空泡。HQ组较HDCP组绒毛纤维素样程度减轻，胎盘绒毛合体滋养细胞结节减少(见图1)。

A：NC组；B：HDCP组；C：HQ组；×400。图1 3组大鼠胎盘组织HE染色结果

2.4 3组大鼠血清中VEGF和TNF-α含量比较 和NC组大鼠血清中VEGF含量相比较，HDCP组显著减少(P<0.05)；干预后的HQ组VEGF含量显著多于HDCP组(P<0.05)。与NC组大鼠血清中TNF-α含量相比较，HDCP组显著增多(P<0.05)，与HDCP组相比，HQ组血清中TNF-α含量显著降低(P<0.05，见表3)。

表3 3组大鼠血清中VEGF含量和TNF-α含量比较

2.5 大鼠胎盘组织中VEGF和TNF-α蛋白水平 与NC组相比较，HDCP组中VEGF蛋白明显减少，TNF-α蛋白的表达明显增加(P<0.05)；与HDCP组相比较，经过黄芪丹参治疗后的HQ组大鼠中VEGF蛋白的表达显著增加，TNF-α蛋白的表达明显减少(P<0.05，见图2、3)。

图2 各组大鼠胎盘组织中VEGF、TNF-α蛋白表达

A:3组大鼠VEGF蛋白比较；B:与3组大鼠TNF-α蛋白比较；*：与NC组比较，P<0.05；#:与HDCP组比较,P<0.05。图3 3组大鼠VEGF和TNF-α的蛋白比较

3 讨论

妊娠高血压疾病包括子痫前期、子痫和妊娠高血压等，是一种妊娠其特有的疾病，多数病理在妊娠终止时，妊娠高血压特有的病理改变会随之出现逆转，由此推测胎盘在妊娠高血压疾病的过程中起重要作用[7]。通常认为在胎盘形成的早期，滋养细胞对子宫内膜浸入过浅，而子宫螺旋小动脉重塑数量减少和重塑障碍，造成胎盘组织缺血缺氧，滋养细胞产生大量“毒性因子”浸入母体血液循环，引起血管内皮细胞损伤，最终导致妊娠高血压疾病的发生[8-9]。血管内皮生长因子(VEGF)不仅能促进血管内皮因子的生长，还能对血管的结构和功能进行有效的维持[10]。有学者研究表明，VEGF的异常表达很可能是导致血管内皮功能障碍的原因之一，也是妊娠期血压升高主要原因[11]。研究也证实，HDCP患者血管内皮的损伤和肿瘤坏死因子(TNF-α)有关[12]。有研究证明血管内皮细胞损伤与TNF-α含量的变化呈正相关，提示TNF-α可能是血管内皮细胞损伤的重要毒性因子之一[13]。目前为止，在临床上对妊娠高血压疾病的治疗，通常都采用硫酸镁注射液进行，并且治疗时一般的联合降压的药物，但这种治疗方法都是针对症状来进行的，不仅会产生大量的不良反应，而且有时候的治疗效果并不是十分理想，如果孕妇长期使用硫酸镁治疗，不仅会威胁母体的健康，对胎儿的健康也造成严重的威胁。所以，研究更多治疗妊娠高血压疾病的药物，对目前的医学工作者来说是最为重要的研究课题。

本文采用黄芪丹参对妊娠高血压大鼠进行干预治疗，并分析其对胎盘组织中VEGF和TNF-α表达的影响。发现和NC组大鼠相比，HDCP组大鼠的血压情况和尿蛋白含量都明显升高；通过给予黄芪丹参进行干预治疗后，与HDCP组大鼠相比HQ组大鼠的血压和24 h尿蛋白浓度都明显降低。HE染色发现，与NC组相比，HDCP组胎盘中绒毛的数量明显减少，组织结构出现萎缩，部分的绒毛出现纤维素样坏死，滋养层细胞代偿性增值。HQ组较HDCP组绒毛纤维素样程度减轻，胎盘绒毛合体滋养细胞结节减少。提示，黄芪丹参对妊娠高血压有明显的治疗作用。在临床上对心脑血管的治疗中，黄芪丹参注射液是最常用的制剂之一，丹参酮是组成丹参的主要成分，可有效改善微循环，同时还对组织的供血供养有一定的增加作用[14]。黄芪注射液主要是由黄芪粉调制而成，不仅能扩张血管，还能让血压抑制肾素明显降低，让血液流变性得到改善的同时，让红细胞携氧能力增加[15]。在中医学中，妊娠高血压被归属为血瘀范围，丹参能活血的同时对化瘀还有明显的成效；黄芪对益气利水有显著成效，把二者联合使用的效果更为显著。

VEGF不仅对血管的生成有一定的促进作用，还能让血管的通透性有效的增加，同时对内膜的完整性有一定的维持作用，而且对滋养细胞的浸润和分化都起着十分重要的作用[16]。本文研究结果显示和NC组大鼠相比，HDCP组大鼠血清中VEGF含量和胎盘中的VEGF蛋白明显减少。VEGF水平的降低可能与其受体的变化有关，还可能与胎盘中内皮细胞、滋养细胞合成、分泌的VEGF蛋白减少有关[17]。TNF是由激活的单核巨噬细胞产生的一种多肽，妊高征时由于免疫失衡及缺氧，导致细胞毒性因子TNF分泌大量增加，引起脂质过氧化，导致血管内皮严重损伤[18]。异常的TNF-α使细胞内钙离子浓度升高而损伤内皮细胞，让组织发生损伤，血管活性物质的释放因此而增加，从而对内皮细胞的增殖和损伤后的修复能有效的抑制。本文研究发现，HDCP组大鼠血清中TNF-α含量和胎盘中的TNF-α蛋白表达明显高于NC组。经过黄芪丹参注射液干预治疗后发现，HQ组大鼠血清VEGF含量和胎盘中VEGF蛋白明显增多，并且血清中TNF-α含量和TNF-α蛋白表达显著低于HDCP组。可见以益气化瘀立法的黄芪丹参有效成分组成的复方，通过促进血管内皮生长因子VEGF蛋白的活性，从而抑制肿瘤坏死因子TNF-α蛋白的表达，以此来达到防治妊娠高血压的目的。郭永平等[19]研究发现，黄芪丹参注射液舒张血管、降低外周阻力、改善胎盘循环的作用可能是通过抑制TNF-α、促进内皮细胞分泌NO而实现的。王静等[20]研究证实，在妊娠高血压疾病中，VEGF、TNF-α会通过一氧化氮的合成在妊娠高血压疾病的发生发展中起着重要的作用。

综上所述，黄芪丹参注射液能促进胎盘组织中VEGF的表达，同时抑制TNF-α的表达，从而对妊娠高血压起到一定的治疗作用。