生防菌K3对甜瓜根结线虫的防治效果

梅雪丽，曹 乐，梁玉蓓，李佳珈，曹翠玲

(1.西北农林科技大学 生命科学学院，陕西杨凌 712100；2.安徽农业大学 植物保护学院，合肥 230036)

根结线虫(Meloidogyne) 是一种分布范围广，多寄生性，对农业造成极大危害的植物寄生虫[1]，现已成为世界性主要病原物[2]。根结线虫会导致植物生产成本增加，效益下滑，感染严重时可造成农作物70%的减产，每年损失高达几十亿美元[3-4]。植物受到根结线虫侵害后，出现植株矮小、枝叶萎缩或黄化及生长发育不良，甚至导致植株枯萎死亡[5]。

施用化学药剂为目前防治根结线虫的主要措施，尽管其效果较为显著，但是长期大量使用易使根结线虫产生抗性，同时破坏生态，危害人、畜健康[6-7]。近年来寻求生物防治代替化学防治成为国内外的大趋势。陈芳等[8]利用生物有机肥在田间对甜瓜根结线虫的防治效果进行试验，发现施用生物有机肥后甜瓜根结线虫的发病率明显降低。梁建根等[9]以番茄为对象，从浙江大学农场蔬菜大棚分离鉴定出巨大芽孢杆菌K-8菌株，研究发现其对番茄感染的南方根结线虫的防治效果优于化学药剂，抑制根结线虫的同时还拥有促进植株生长的作用。高亮等[10]利用粉状毕赤酵母菌AS2.2514生产出生物菌剂，使得土壤中南方根结线虫数量明显减少，根系中根结比率降低。戴梅等[11]发现，多粘芽孢杆菌、B697菌株、巨大芽孢杆菌和A135菌株等根围促生细菌对南方根结线虫的防效分别达65.4%、68.2%、53.8%和53.8%。关于根结线虫的生物防治，国内外有较多的研究成果，但研究对象大多以黄瓜、番茄等经济作物为主，对甜瓜的研究较少，且研究时关注较多的是生防菌剂的施用密度，对生防菌施用的具体时期研究较少。

谢惠琴[12]研究发现，生防菌K3能够促进甜瓜生长，提高果实品质，防治甜瓜根结线虫。本试验在此基础上，通过研究对比生防菌K3不同施用量及在甜瓜不同生长发育时期施用对甜瓜根结线虫的抑制效应，以期寻找可以产生最大抑制效应的施用量与施用时期，为生产中如何更加高效地防治根结线虫提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

生防菌K3由西北农林科技大学生命学院曹翠玲教授实验室筛选、鉴定并保存[12]。K3菌剂有效活菌数为3.01×1010cfu/g。甜瓜品种为‘西农早蜜1号’(为根结线虫敏感型)。

试验于2018年10月-2019年6月在西北农林科技大学生命科学学院进行。甜瓜种子用1% NaClO消毒5 min，再用75%酒精浸泡 5 min，蒸馏水冲洗3次，平铺在培养皿中，盖上润湿纱布，30 ℃下催芽，种子露白后，挑取长势一致的种子，点播在基质土中。待甜瓜长至一叶一心期时，选择长势一致的幼苗移入不同处理的土壤中，每盆一株甜瓜幼苗。25 ℃、16 h光照/8 h黑暗下培养。试验所用土壤前茬为小麦土，每袋 1 kg干土。装盆时，将基肥(硝酸钾和过磷酸钙用量分别为0.054 g/kg、0.94 g/kg)拌入土壤，搅拌均匀。移苗30 d后测定各项指标，每个处理3次重复。

1.2 方 法

1.2.1 根结线虫悬液制备 将长有大量根结的甜瓜病根用流水冲洗干净，1%的NaClO浸泡消毒3 min，无菌水漂洗3遍后，切成0.05 cm块状，置于无菌培养皿中，加无菌水漫过根部组织块，30 ℃下孵化24 h后，双层纱布过滤，收集滤液中的根结线虫[13-14]。2 000 r/min离心5 min，制成约1 000条/mL根结线虫悬液。在甜瓜移苗3 d后用注射器将根结线虫悬液接种至甜瓜根际(2 mL/株)，作为接种处理。

1.2.2 K3不同施用量对甜瓜根结线虫的抑制效应 试验设置4个处理，分别为：土壤中不施用菌剂与根结线虫(CK0)；土壤中仅接种根结线虫(CK1)；土壤中施用K3菌剂4 g/kg并接种根结线虫(K3L)；土壤中施用K3菌剂 8 g/kg并接种根结线虫(K3H)。每处理重复3次。K3菌剂在甜瓜移苗前拌入土壤，根结线虫接种方法同 “1.2.1”，接种量均为2 000条/株。

1.2.3 K3不同施用时期对甜瓜根结线虫的抑制效应 试验设置4个处理，分别为：土壤中不施用菌剂与根结线虫(CK0)；仅接种根结线虫(CK1)；接种根结线虫并在甜瓜幼苗期(一叶一心期)施用K3菌剂8 g/kg(K3S)；接种根结线虫并在甜瓜伸蔓期(四叶一心期)施用K3菌剂8 g/kg(K3V)。每处理重复3次。根结线虫接种方法和接种量同“1.2.2”。

1.2.4 测定指标及方法 甜瓜形态学指标：选取各处理甜瓜植株，用清水洗净叶片及根部的泥土，将植株在平台上完整展开，测量株高、根长、叶面积、地上鲜质量和根鲜质量。每处理重复3次。

甜瓜根结线虫病情指数：选择每个处理完整的根，根据公式计算感染率(Infection，I)、根结指数和相对防效，每株植株的根结线虫侵染分为 4个等级(0：I=0%；1：I=1%～25%；2：I= 26%～50%；3：I=51%～75%；4：I=76%～100%)[15]。

感染率=根结感染的侧根数/总侧根数×100%

根结指数=Σ(疾病等级×相应等级的植株数量)/(4×植株总数)×100%

相对防效=(对照组根结指数-处理根结指数)/对照根结指数×100%

植株抗性酶活性、根系活力：甜瓜幼苗叶片苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、多酚氧化酶(PPO)活性参考曹翠玲等[16]的方法进行测定。

1.3 数据分析

采用 Excel 2007 和SPSS 23对试验数据进行统计分析，以LSD 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 K3施用量与施用时期对接种根结线虫甜瓜幼苗生长的影响

甜瓜幼苗在接种根结线虫后，其生长受到抑制(图1～图2)。对甜瓜幼苗的生物量和农艺性状分析表明，在施加K3菌剂并接种根结线虫后，甜瓜幼苗株高、根长、叶片数、最大叶面积、地上鲜质量均降低，而根鲜质量显著增加(表1、表2)，原因为根结线虫侵染甜瓜幼苗形成根结，并且施加K3菌剂后，甜瓜根系较为发达，表明K3菌剂能够促进甜瓜根系生长，从而使根鲜质量增加。与CK1相比，甜瓜幼苗株高、根长、叶片数、最大叶面积、地上鲜质量随K3菌剂施用量的增加而提高，且K3H处理最高(表1)。在K3施用量为8 g/kg时，相比于伸蔓期，在甜瓜幼苗期施用K3菌剂对甜瓜幼苗生长的促进效果较好(表2)。

CK0.对照；CK1.接种根结线虫；K3L.施用K3菌剂4 g/kg并接种根结线虫；K3H.施用K3菌剂8 g/kg并接种根结线虫。下表1、3、5同此

CK0.对照；CK1.接种根结线虫；K3S.接种根结线虫并在甜瓜幼苗期施用K3菌剂；K3V.接种根结线虫并在甜瓜伸蔓期施用K3菌剂。下表2、4、6同此

表1 K3不同施用量下甜瓜幼苗的农艺性状及生物量Table 1 Agronomic traits and biomass of melon under different K3 application amounts

表2 不同时期施加K3后甜瓜农艺性状及生物量Table 2 Agronomic traits and biomass of melon under application of K3 in different periods

2.2 K3施用量与施用时期对甜瓜根结线虫防治效果

K3菌剂施用量对甜瓜根结线虫防治效果试验结果表明，施加K3菌剂后，甜瓜根系的生长较发达(图3)，在K3施用量较高时(8 g/kg)对甜瓜根结线虫的防治效果达66.7%(表3)，K3H对甜瓜根结线虫的抑制效果明显强于K3L。而在K3施用量为8 g/kg时，K3菌剂在甜瓜幼苗期和伸蔓期施用对甜瓜根结线虫防治效果均为100%(表4)，对甜瓜幼苗根系的生长也有明显促进作用(图4)。

图3 K3不同施用量下甜瓜幼苗根系生长情况Fig.3 The effect of different K3 application amounts on the growth of melon seedlings roots

表3 K3不同施用量对甜瓜根结线虫的防治效果Table 3 Control effect of K3 application amounts on melon root-knot nematode

表4 不同时期施加K3对甜瓜根结线虫的防治效果Table 4 Control effect of K3 application against melon root-knot nematode in different periods %

2.3 K3施用量与施用时期对接种根结线虫甜瓜幼苗抗性酶活性的影响

由表5可知，甜瓜叶片中PAL、PPO和CAT活性随K3施用量的增加而增强。由表6可知，幼苗期和伸蔓期接种根结线虫后，甜瓜叶片PAL、CAT和PPO酶活性高于CK1，且K3S中PAL和CAT酶活性高于K3V，说明不同时期施加K3均可在一定程度上提高甜瓜叶片中抗性酶活性，但在幼苗期施加K3促进作用更强。

表5 K3不同施加量下甜瓜叶片抗性酶活性Table 5 Melon leaf resistance enzyme activities under different K3 application amounts

图4 不同时期施用K3后甜瓜幼苗根系生长情况Fig.4 Effects of applying K3 in different periods on melon roots growth status

表6 不同时期施加K3后甜瓜叶片抗性酶活性Table 6 Melon leaf resistant enzyme activities under application of K3 in different periods

3 讨 论

根结线虫侵染甜瓜后，甜瓜的生长受到明显抑制，根系不发达且植株矮小。根结线虫由土壤间隙侵入甜瓜根部并形成根结，破坏根系结构，从而影响甜瓜的正常生长。作为新型防治手段之一的生物防治，其环境友好，有广泛的应用潜力，近年来受到国内外的普遍关注。K3能够促进甜瓜幼苗的生长[12]，在本研究中K3不仅促进甜瓜的生长，还在一定程度上抑制根结线虫侵入及根结形成，施加K3后，甜瓜株高、根长、叶片数、最大叶面积、鲜质量均有较明显增加，根结线虫的感染率和根结指数也明显降低。对根结线虫的防治效果研究与陈芳等[8]利用生物有机肥对甜瓜根结线虫田间防治效果研究结果一致，而根鲜质量却与其研究结果不一致，原因为K3能够明显的促进甜瓜根系生长[12]，施加K3后甜瓜根系较为发达，根鲜质量显著增加。在幼苗期和伸蔓期施加K3，由于并未在甜瓜根部发现根结，仅说明K3可有效抑制根结线虫侵入甜瓜根部，K3是否还能直接杀死根结线虫，尚需进一步研究。

植物体内的防御体系是一个复杂的体系，包括多种防御酶及抗病物质，而这些不同的因素并不是单独的发挥着作用，而是通过相互协调、作用以共同抵御各类胁迫[17-20]。植株受根结线虫侵染后会产生某些生理生化反应抵御侵害，主要表现为活性氧含量增加、抗性酶系活性增强、次生代谢物质和病程蛋白(PR)产生等[21]。植物体内的抗性酶系包括POD、PAL和PPO等。本研究测定PAL、CAT和PPO活性，在接种根结线虫后，甜瓜处于生物胁迫下，甜瓜叶片中PAL和PPO活性增强[22]，直接增强植物抗性，而CAT活性降低[23]。

PAL、CAT和PPO 3种酶于不同时期在甜瓜防御系统的不同位置发挥不同作用，而K3对PAL、PPO和CAT的活性也有不同影响。幼苗期和伸蔓期施加K3后甜瓜叶片PAL、PPO和CAT活性均提高。而在幼苗期施加不同浓度的K3时，PAL和PPO活性升高，CAT活性降低。研究发现，接种AM真菌提高了黄瓜幼苗PAL、PPO活性及多酚含量，表明接种AM真菌可提高黄瓜幼苗对根结线虫侵染的抗性[24]。商桑等[25]发现，穿刺巴斯德芽菌接种后根系中SOD与POD活性逐渐下降，而CAT活性迅速下降，说明穿刺巴斯德芽菌能够使保护酶活性升高和下降的幅度变缓，降低膜脂过氧化作用。丛枝菌根真菌和植物根围促生细菌组合菌剂能够提高与黄瓜抗逆性相关的SOD、POD和CAT活性，从而提高对黄瓜根结线虫抗性[26]。本研究结果表明，在甜瓜幼苗期施加K3菌剂8 g/kg能较好地诱导甜瓜抗性增强。