过表达MicroRNA-612对SiHa细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

葛爱娟，王小红，叶 红

（中国人民解放军联勤保障部队第904医院妇产科，无锡 214000）

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌，并在世界范围内明显上升[1]。据统计[2]，全球每年约有46.6万宫颈癌新发病例。我国每年估计新发宫颈癌病例13.5万，约占全世界新发人数的28.7%。因此，早发现早治疗尤为重要。微小RNA（microRNAs，miRNA）是一类长度为19～25个核苷酸的非编码RNA分子，能通过与靶基因的3'-非翻译区结合来调节基因表达[3]。越来越多的证据[4-5]表明，miRNA在肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭及转移等过程中发挥着重要作用。miR-612是一类位于11号染色体上的miRNA，并在几种人类癌症中存在异常表达[6-8]，如膀胱癌、肝癌、胃癌等。然而，miR-612在宫颈癌中的作用尚未报道。为此本文研究了miR-612在体外对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响，以此为临床早期诊治宫颈癌提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人宫颈癌SiHa细胞系（上海通派生物科技有限公司）；氯仿、异丙醇、乙醇（上海化学试剂有限公司）；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂、cDNA Reverse Transcription kit、RNAiso plus（D9108A）Trizol（大连宝生物Takara公司）；DMEM培养基（上海索莱宝生物科技有限公司）；青链霉素、胎牛血清、DMSO、0.25%胰酶消化液（美国Gibco公司）；Lipofectamine2000［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；miR-612 mimic、miR-612 minic-NC（广州市锐博生物科技有限公司）；CCK-8试剂盒（上海东仁化学科技有限公司）；PI染液、Matrigel（美国BD公司）；Transwell小室（美国Millipore公司）；结晶紫（美国Sigma公司）。

1.2 主要仪器

高速低温离心机（德国Eppendorf公司）、ABI7500 PCR仪器（美国Applied Biosystems公司）、PCR扩增仪（美国Life Technologies公司）、超净工作台（新加坡Esco公司）、二氧化碳（CO2）培养箱（美国Thermo Electron Corporation公司）、SpectraMax M5酶标仪（美国Molecular Device公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞转染与分组 将宫颈癌SiHa细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM液中，置于37℃、5%CO2的恒温箱中，当细胞增殖到80%汇合度时进行传代。用Lipofectamine2000分别将miR-612模拟物、miR-612 NC转染至SiHa细胞，并分为miR-612 mimic组（转染miR-612模拟物，5 nmol）、miR-612 mimic-NC组（转染miR-612 NC，5 nmol）和空白对照组（不做任何处理），操作步骤严格按照Lipofectamine2000说明书进行。

1.3.2 qRT-PCR法检测各组SiHa细胞miR-612的表达水平 使用Trizol试剂分别从各组SiHa细胞中提取总RNA，逆转录获得cDNA。miR-612以U6作为内参。采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测各组SiHa细胞中miR-612的表达水平。扩增条件：94℃预变性2 min；94℃变性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环。PCR引物序列：miR-612正义：5'-GCAGGGCTTCTGAGCTCCTTAA-3'，反义：5'-CAAATTCGTGAA GCGTTCCATAT-3'；U6正义：5'-TGCGGGTGCT CGCTTCGCAGC-3'，反义：5'-CCAGTGCAGGGTC CGAGGT-3'。PCR扩增完毕后进行熔解曲线分析，根据内参，按公式（2-△△Ct法）计算目的基因miR-612的表达水平，每次操作设立3个复孔并取平均值。

1.3.3 CCK-8法检测各组SiHa细胞的增殖情况 将转染48 h后的细胞消化接种于96孔板中，每孔培养液总体积100μL（3 000 cells），置于37℃、CO2培养箱，待其贴壁，更换培养基，每孔加入混有10%CCK-8检测试剂的培养液，37℃孵育1 h。从培养箱取出并于避光条件下在450 nm处检测吸光度，判断第24、48、72及96 h时细胞的增殖情况，实验重复3次。

1.3.4 流式细胞术检测各组SiHa细胞的细胞周期 采用适量的胰酶消化、收集转染48 h后的宫颈癌SiHa细胞，以2 000 r·min-1离心5 min，磷酸缓冲液（PBS）清洗2次，收集并置于预冷的70%乙醇，于4℃下固定过夜。后于2 000 r·min-1速度离心15 min收集固定细胞，用100μL PBS重悬细胞并转至试管中轻轻吹打（防止细胞破碎）。加50μL PI染液和2μL核糖糖酸酶（RNase）于室温放置15 min。流式细胞仪检测各组SiHa细胞周期变化，应用ModFit LT软件分析结果，实验重复3次。

1.3.5 细胞划痕实验检测各组SiHa细胞的迁移能力 在培养于6孔板上的转染后48 h的各组SiHa细胞上做划痕实验，用1μL枪头在6孔板上均匀划痕，用PBS洗涤3次，加入DMEM；置于37℃、5%CO2的恒温箱中进行培养。于0 h和24 h时在显微镜下取点，观察并拍照。以划痕两侧细胞间的距离为划痕宽度，计算相对划痕宽度，相对划痕宽度=24 h划痕宽度/0 h划痕宽度。实验重复3次。

1.3.6 Transwell检测各组细胞的侵袭能力 收集转染48 h后的宫颈癌SiHa细胞，将稀释好的Matrigel胶100μL小心垂直加入预冷的8μm聚碳酯膜的Transwell小室（冰上操作），置于37℃培养30 min。取0.2 mL细胞悬液接种于Transwell小室上层，下层注入0.5 mL含20%胎牛血清的培养液，置于37℃孵箱孵育24 h。将膜下层细胞同1%多聚甲醛混合，用0.2%结晶紫溶液染色15 min，倒去染液，PBS清洗5 min×3次，于镜下观察拍照，随机选取6个视野计数后取平均值。实验重复3次。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-612在各组SiHa细胞中的表达情况

与miR-612 mimic-NC组和空白对照组比较，miR-612 mimic组miR-612表达水平增高（P均＜0.05），见图1，提示转染成功。

图1 qRT-PCR检测miR-612在各组SiHa细胞中的表达情况

2.2 过表达miR-612对SiHa细胞增殖的影响

与miR-612 mimic-NC组和空白对照组比较，miR-612 mimic组细胞的增殖能力受到明显抑制（P均＜0.05），见图2。

图2 CCK-8法检测各组SiHa细胞的增殖情况

2.3 过表达miR-612对SiHa细胞周期的影响

转染miR-612模拟物后，miR-612 mimic组处于G0/G1期细胞的比例高于miR-612 mimic-NC组和空白对照组（P均＜0.05）；miR-612 mimic组处于S期细胞的比例低于miR-612 mimic-NC组和空白对照组（P均＜0.05）；miR-612 mimic组处于G2/M期细胞的比例与miR-612 mimic-NC组和空白对照组比较差异均无统计学意义（P均＞0.05），见图3。提示miR-612过表达增加了SiHa细胞G0/G1期的比例，减少了细胞S期的比例。

图3 流式细胞术检测各组SiHa细胞的细胞周期

2.4 过表达miR-612对SiHa细胞迁移的影响

各组细胞于转染48 h后行细胞划痕试验，与miR-612 mimic-NC组和空白对照组比较，miR-612 mimic组细胞的迁移愈合距离受到明显抑制（P均＜0.05），见图4。

图4 各组SiHa细胞24 h后划痕愈合情况

2.5 过表达miR-612对SiHa细胞侵袭的影响

miR-612 mimic组侵出小室的细胞数较miR-612 mimic-NC组和空白对照组均降低（P均＜0.05），见图5。提示过表达miR-612能抑制SiHa细胞的侵袭能力。

图5 Transwell检测各组SiHa细胞侵袭能力

3 讨论

宫颈癌的发生和发展是一个复杂的、多步骤、多基因参与的过程[9]。尽管目前临床拥有化疗、放疗、手术治疗等多种有效方法治疗宫颈癌，但宫颈癌患者的病死率仍居高不下，最主要的原因就是宫颈癌细胞发生了侵袭与转移[10]。故寻找抗肿瘤细胞侵袭和转移的新疗法已成为当前热点及难点问题。在人类基因组中存在超过1 000多个miRNAs，每一个都可能调控数百个信使RNA（mRNA）。越来越多的证据[11-12]表明，miRNAs在大多数恶性肿瘤的发病机制中具有致癌或抑癌功能，其中许多与宫颈癌的发生和发展密切相关。

本研究的miR-612定位于11号染色体上，在不同肿瘤类型中表现出不同的表达水平。Sheng等[13]研究表明，miR-612在结直肠癌组织及细胞中表达下调，这与miR-612直接抑制蛋白激酶B2（AKT2），进而抑制下游上皮间质转化相关信号通路有关。Zhou等[14]发现，miR-612在食管鳞癌组织及细胞中高表达，可能通过调控肿瘤抑制蛋白P53（TP53）的表达来影响食管鳞癌细胞的迁移及侵袭。本实验采用Lipofectamine2000分别将miR-612模拟物、miR-612 NC转染至人宫颈癌SiHa细胞，并采用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测各组SiHa细胞miR-612的表达水平，发现miR-612 mimic组miR-612表达水平高于miR-612 mimic-NC组和空白对照组，提示本研究成功建立miR-612过表达SiHa细胞模型。进而，采用CCK-8法检测了各组SiHa细胞的增殖情况，发现与miR-612 mimic-NC组和空白对照组比较，miR-612 mimic组各时段的增殖均受到抑制，提示过表达miR-612可抑制SiHa细胞的增殖。采用流式细胞术检测miR-612模拟物处理后的SiHa细胞，发现其G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例降低。推测miR-612过表达可能通过使SiHa细胞持续处于G0/G1期来抑制其增殖。采用细胞划痕实验以及Transwell实验分别检测各组SiHa细胞的迁移和侵袭能力，发现miR-612 mimic组的迁移和侵袭能力均较miR-612 mimic-NC组和空白对照组降低，提示过表达miR-612会抑制SiHa细胞的迁移和侵袭。

综上，过表达miR-612能使宫颈癌SiHa细胞的增殖活性降低、使G0/G1期的细胞比例增加、抑制SiHa细胞的迁移和侵袭。此后，以miR-612作用于宫颈癌的机制作为重点研究方向，从而为宫颈癌的早期诊治及判断miR-612如何参与宫颈癌的发生和发展提供更为有力的科学依据。