基于网络药理学初步探索散偏汤治疗偏头痛的作用机制

杨柳青，范 博，陈莉萍,2，李 玲*，陈慧娟

（1.西华大学食品与生物工程学院,四川成都 610039；2.成都中医药大学药学院,四川成都 611137；3.四川省第二中医医院，四川成都 610014）

偏头痛是临床常见的一种原发性头痛，表现为反复发作的单侧或双侧搏动性头痛，它主要是由于颅内血管舒缩功能障碍而引起头部偏侧疼痛，常间歇性发作，且病程持久。中医称偏头痛为“头风”，多是由于七情内伤，气血瘀阻经络，连及脏腑，复受外邪侵袭而引发的一种周期性发作的疾病[1]。世界卫生组织调查显示，人群中偏头痛患病率为15%～18%[2]，我国是患偏头痛人数最多的国家。目前用于偏头痛发作期治疗的药物包括非甾体类抗炎药、阿片类药物，麦角类制剂和曲普坦类特异性药物[3]，用于预防期的药物有钙通道与β 受体阻滞剂、抗抑郁药、抗癫痫药等[4]。中医用药主要有散偏汤、川芎茶调散、天麻钩藤汤、血府逐瘀汤等[5]。

散偏汤出自清《辨证录》，现收录于国家中医药管理局发布的《古代经典名方目录（第一批）》之中。全方由白芍五钱，川芎一两，白芷五分，郁李仁一钱，柴胡一钱，白芥子三钱，香附二钱，甘草一钱组成，具有疏风止痛和利肝胆之功效。主要治疗半边头风证，现阶段散偏汤治疗偏头痛的研究文献较多，临床治疗效果显著，无明显不良反应[6−7]。现代药理学研究发现，散偏汤方剂中八味药均有不同程度的镇静镇痛功效[7]，但目前对散偏汤治疗偏头痛的作用机制研究较少。因此本文欲采用网络药理学方法，探索散偏汤治疗偏头痛的作用机制。

网络药理学是基于系统生物学和网络生物学研究药物与靶点之间“多成分、多靶点、多通路”的一门学科，现阶段网络药理学在中药治疗疾病作用机制的初步研究方面提供了很好的参考价值。本文也将通过网络药理学方法对散偏汤治疗偏头痛的作用机制进行探索，为后续的研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 散偏汤主要活性成分和靶点

预测利用TCMSP 数据库（https://tcmspw.com/tcmsp.php）经过ADME 筛选后收集白芷、白芍、川芎、柴胡、甘草、香附、郁李仁的化学成分，以类药性（DL）≥0.18 且口服生物利用度（OB）≥30%筛选出7 种药物的主要活性成分。方剂中白芥子在TCMSP 数据库中并未收纳，利用中医药综合数据库（TCMID）（http://119.3.41.228:8000/tcmid/）查找白芥子的主要活性成分，根据其CAS 号或化学名称在TCMSP 中查出活性成分的OB、DL 值。

筛选后得到的药物活性成分在PubChem 数据库[8]中下载对应成分的化学结构SDF 文件。药物靶点的预测使用SwissTargetPrediction 数据库（http://www.swiss-targetprediction.ch/）,在其页面提交所下载的SDF 文件，进行靶点预测，选择可能性大于0 的靶点，即可得到所预测成分的靶点。

1.2 疾病靶点筛选和交集靶点和获取

在OMIM 数据库（https://omim.org/）[9]的Gene Map 页面和GeneCards 数据库（www.genecards.org）[10]中以“migraine”为关键词进行搜索，查找有关偏头痛的靶点，去除重复靶点，合并两个数据库的靶点再次去重即得到偏头痛相关靶点。利用微生信网站的jvenn 网站（www.bioinformatics.com.cn/stat-ic/others/jvenn/example.html）[11]提交筛选出的药物靶点和疾病靶点，生成“药物-疾病”共有靶点韦恩图，得到散偏汤治疗偏头痛共有靶点。

1.3 偏头痛与药物交集靶点PPI 网络构建

相关蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)网络的构建是将共有靶点导入STRING 数据库[12](https://www.string-db.org/），提交搜索，设置为高置信区间>0.9，隐藏游离的靶点，下载蛋白质相互作用数据tsv 文件,导入Cytoscape3.7.2 软件,构建PPI 网络图。使用软件中的cytoHubba插件筛选出关键基因，其中设置为前30 个节点，排序算法选择MCC（maximum clique centrality,最大团中心性）。

1.4 药物−靶点−疾病网络构建

用Excel 软件制作“Network”和“Type”文件，导入Cytoscape3.7.2 软件，构建“药物-靶点-疾病”关系图，其中节点表示药物、活性成分、靶点、疾病，边则表示某两种组分之间的联系。运用软件中的Network Analyzer 工具分析所得到的网络。

1.5 靶点的功能及通路分析

将共有靶点导入Metascape 数据库（http://metascape.org/gp/index.html）[13]，进行京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of gene and genomes,KEGG)分析和基因本体论（gene ontology,GO）分析。设置最小有3 个基因在通路上即被显示，P 值设置为0.01，最小富集为1.5，分别对KEGG 通路、生物过程（biological processes）、细胞组分（cellular components）以及分子功能（molecular functions）进行富集分析，下载分析好的全部文件。

2 结果

2.1 药物成分和疾病靶点分析

经过筛选，共得到157 个活性成分，其中有8 个成分是多种中药所共有成分。SwissTargetPredict数据库预测获得1066 个药物作用靶点。以“migraine”在OMIM 和GeneCards 数据库中搜索其靶点，将两个数据库靶点合并去重之后，共得到1045 个疾病靶点。把所得到的药物作用靶点和疾病靶点导入jvenn 数据库，绘制韦恩图，得到205 个疾病与药物共同靶点。韦恩图如图1 所示。

图1 散偏汤潜在靶点和偏头痛疾病靶点韦恩图

2.2 散偏汤治疗偏头痛的PPI 网络

PPI 网络图由175 个蛋白靶点以及904 条偏头痛相关的蛋白质互作关系组成，通过对该网络无向的分析得到该网络节点平均自由度为10.33，该网络由6 个连接紧密的模块组成。蛋白质相互作用网络图如图2 所示。利用cytoHubba 插件得到此网络中前25 个关键基因，如表1 所示。

表1 PPI 网络MCC 评分前25 位关键基因

图2 散偏汤治疗偏头痛相关靶点PPI 网络图

2.3 散偏汤治疗偏头痛的“药物-靶点-疾病”网络

本研究中，运用Cytoscape3.7.2 软件，对散偏汤的八味中药，157 个活性成分，偏头痛和药物的205 个共同靶点构建了可视化的双向交互网络。该网络图由371 个节点、3283 条边组成，如图3。对网络图进行分析，去除散偏汤、偏头痛以及八味药节点，计算得到平均节点自由度为17.09，节点度值大于17 的节点总共有157 个，有63 个为散偏汤治疗偏头痛的相关靶点节点，94 个为八味药的活性成分节点，分别列出了前30 个重要的基因以及活性成分，如下表2、表3 所示。

表2 “药物-靶点-疾病”网络大于平均自由度的30 个靶点

表3 “药物−靶点−疾病”网络大于平均自由度的30 个成分节点

图3 散偏汤治疗偏头痛的“药物−靶点−疾病”交互网络图

由表2 可知，CYP19A1、ESR2、ESR1、ADORA-2A、EGFR、ADORA1、MAOA 均有非常高的自由度，远高于平均自由度的3 倍。由表3 可知，活性成分自由度相较靶点自由度要小，活性成分中自由度最高的是山柰酚，其为白芍、郁李仁、柴胡、香附、甘草共有成分，依次是罗通定，是香附中的成分，独活素，为白芷的一种香豆素活性成分。由此看出，散偏汤功效是多种药物与多种靶点共同作用的结果。

2.4 KEGG 通路富集分析

将共有靶点导入Metascape 数据库进行KEGG通路富集分析，最终得到334 条通路，按照通路上基因数量由大到小排序，我们列出了前20 条信号通路，其中包括有神经活性配体-受体相互作用、MAPK 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、HIF-1 信号通路等。运用微生信在线作图网站[14]（http://www.bioinformatics.com.cn/plot_basic_horizontal_ba r_062）绘制出条形图，如图4(a)所示。并运用易汉博生物信息在线作图工具(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/GOenrichmentplot.h tml）绘制出了气泡图，如图4(b)所示。

图4 散偏汤治疗偏头痛潜在靶点KEGG 富集分析柱状图（a）以及气泡图（b）

对205 个共同靶点利用Metascape 数据库进行GO 分析。得到生物过程相关的GO-BP 总共为306 条，根据在此生物过程中基因数目由大到小排序，共列出前20 个生物相关过程。其中包含突触信号转导、循环系统进程、无机离子稳态、分泌调节生物过程等。GO-CC 分析总共得到108 个细胞成分相关条目，列出的前20 条细胞组分有突触后、突触前、突触膜、受体复合体、细胞体等。GOMF 分析总共得到136 个分子功能相关条目，前20 条包含有通道活性、神经递质受体活性、门控通道活性、激酶活性等。

将筛选出的前20 条GO-BP、GO-CC、GOMF 运用微生信在线作图工具绘制三合一的柱状图，如图5（a）。同时运用易汉博生物信息在线作图工具绘制出气泡图，如图5(b)、5（c）、5（d）所示。

图5 散偏汤治疗偏头痛潜在靶点GO 富集分析柱状图及气泡图

3 讨论

散偏汤治疗偏头痛效果良好，但目前对其药理机制研究较少。为研究其作用机制，本次研究对散偏汤治疗偏头痛的205 个共同靶点以及散偏汤中八味中药的主要活性成分进行了网络药理学分析。PPI 网络分析发现该网络由6 个联系紧密的模块组成，筛选出排名前25 的关键基因。排在首位的是APP（淀粉样蛋白-β 前体），其裂解产生的淀粉样蛋白-β 被看作是阿尔兹海默病发生的关键性物质，并且APP751和APP770广泛表达于脑外周[15]，偏头痛的发生可能与其相关。OPRK1 是κ 型阿片受体，参与人体感觉的调节。在Lindsey M.Snyder 等[16]的研究中，κ 型阿片受体在不同感觉神经元中表达，外周选择性的κ 型阿片受体激动剂可以减少疼痛和神经源性炎症。CCR5 和CXCL8 都属于趋化因子，CCR5 的拮抗剂可以减少细胞炎症因子释放，炎症减轻，SARS-CoV-2 血浆病毒血症减少[17]；CXCL8 能响应炎症刺激，加大CXCL5、CXCL8 和CXCL10 的表达会加重牙周炎症和破坏[18]。散偏汤对于偏头痛的治疗可能存在与上述中相关或相同的作用机制，但并无有关文献报道具体机制，还需要进一步实验验证其具体机制。

分析“药物−疾病−靶点”网络的结果显示，节点自由度排名靠前的依次是山柰酚、罗通定、独活素。山柰酚具有抗癌、抗氧化作用，与铜离子络合后能有效地清除自由基，在一定条件下对DNA 有保护作用[19]；山柰酚能通过调控circNOL12/miR-6873-3p/FRS2 轴减轻ox-LDL 诱导的人静脉内皮细胞的炎症、凋亡和氧化应激反应[20]，还具有减轻糖尿病肾病的作用[21]。罗通定是多巴胺受体D2的阻断剂，主要体现为镇痛作用，此外还有镇静催眠、镇咳、治疗高血压、心律失常等作用[22]。Santhana Krishnan 等[23]的研究证实独活素对水稻黄单胞菌和林炭疽菌的抑菌活性；Haripriya Shanmugam 等[24]的研究表明独活素具有骨再生能力，或可用于骨质疏松症。山柰酚的减轻炎症作用，罗通定的镇痛、镇静作用，都与改善偏头痛症状相符合。

偏头痛发生的一个主要病因被认为是参与疼痛和炎症传播的中枢和外周神经系统和血管壁之间作用的不平衡，导致扩散性皮质抑制和三叉神经血管系统兴奋性阈值降低[25]。KEGG 富集分析结果显示，散偏汤或是通过调控MAPK、PI3K-Akt、HIF-1 等信号通路来实现其对偏头痛的治疗作用。MAPK 通路在细胞的增殖、凋亡、炎症等多方面发挥着关键作用。体内研究显示，抑制JNK 和p38MAPK 这两条并行的“应激诱导”MAPK 通路并激活NF-κB 可以减轻偏头痛炎症反应的发生[26]。偏头痛大鼠模型脑组织PI3K/Akt 信号通路被激活[27]，人肾小管上皮细胞炎症加重时PI3K/Akt/NFκB 信号通路的表达较高[28]，这些结果均表明PI3K/Akt 通路在炎症细胞内表达较高。HIF-1(缺氧诱导因子)是神经系统中的关键性神经保护因子，在机体低氧浓度时或缺氧应答时至关重要[29]。HIF-1 信号通路能够激活NO，影响炎症反应，参与血管平滑肌舒张，散偏汤治疗偏头痛也可能与此作用机制相关。HIF-1α 通路上的NOS2/NOS3/IL6/VEGEA 等基因介导的炎症和血管舒缩可能是散偏汤治疗偏头痛的重要机制。GO 分析结果表明，偏头痛受多种细胞行为、分子功能调控，包含突触信号的转导、传递，体内稳态调节，循环系统参与，通道活性、激酶活性等。

综上，网络药理学结果显示，散偏汤治疗偏头痛可能活性成分有山柰酚、罗通定、独活素等，得分较高靶点有APP、CCR5、CXCL8、OPRK1 等；散偏汤对偏头痛治疗效果与MAPK、PI3K-Akt、HIF-1 等信号通路存在一定相关性，或也参与了突触信号传递、稳态调节、通道活性、酶活性等生物学过程。本次研究初步探索了散偏汤治疗偏头痛的主要活性成分及作用机制，为后续深入研究提供了一定的实验基础和参考。鉴于网络药理学缺乏实验验证的局限性，课题组将采用验证实验对散偏汤治疗偏头痛的作用机制进行下一步研究。