广东省4株PCV2型分离株全基因组进化分析

羊露露，李安琪，袁 生，黄良宗，黄淑坚，温 峰，郭锦玥

(佛山科学技术学院生命科学与工程学院，佛山 528231)

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是圆环病毒科圆环病毒属的成员，为单链环状DNA病毒[1]。该病毒无囊膜、呈二十面体对称结构，直径为12～23 nm，是目前已知最小的病毒[2]。目前发现PCV有4种基因型：PCV1、PCV2、PCV3和PCV4[3-4]。PCV1最先在猪肾细胞系中发现，对猪是无致病性的[5]；PCV2临床上可引起猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、急性肺水肿(acute pulmonary edema,APE)及断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)等[6-7]；PCV3也可引起PDNS、母猪繁殖障碍和多系统炎症等临床症状[8-9]；PCV4是2019年从中国湖南几头患有严重临床疾病的猪中发现的，其临床症状主要表现为呼吸系统疾病、腹泻和PDNS等[4]，该病毒的致病机理还有待进一步研究。

PCV2于1991年在加拿大首次发现，在全球有很高的患病率，给养猪业造成相当大的经济损失[7]。PCV2基因组长度约为1 767 bp，编码11个开放阅读框(open reading frame 1～11,ORF1～11)，包含2个主要的开放阅读框：ORF1和ORF2，ORF1编码2个与复制相关的蛋白，分别为Rep和Rep′，ORF2编码Cap蛋白，Cap蛋白是PCV2中唯一含有与病毒中和相关重要免疫表位的结构蛋白[10-11]。根据全基因组和Cap基因的系统进化树分型可将PCV2分为8个基因型，即PCV2a～PCV2h[12]，其中PCV2a、PCV2b和PCV2d是目前中国流行株的3种主要基因型[13-14]。由于PCV2基因组易发生点突变和基因重组现象，因此导致PCV2具有遗传多样性，使得PCV2流行株呈现复杂化和多元化现象[15]。

本研究于2020-2021年从广东省几个疑似PCV2感染发病的猪场中检测到4株PCV2毒株，并与GenBank中公布的PCV2参考毒株进行相似性比对和遗传进化分析，对了解广东省近几年PCV2流行情况及遗传进化特征具有重要意义，也为PCV2疾病防控及疫苗毒株的选用和研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 4株PCV2广东分离株GD-1、GD-2、GD-3和GD-4的病料分别来源于2020-2021年广东省韶关、茂名、佛山、云浮4个地区，采集临床症状呈现PMWS特征的发病猪的肺脏、脾脏、淋巴结等组织，-80 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 病毒DNA提取试剂盒购自艾瑞科生物科技有限公司；2×TransTaqHiFi PCR SuperMix均购自北京全式金生物技术有限公司；pMD18-T载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞、DL2000 DNA Marker均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中公布的PCV2全基因组序列(登录号：KT719404)，利用Primer Premier 5.0软件设计1对引物，引物序列为：F：5′-ACCAGCGCACTTCGGCAGCG-3′；R：5′-AATACTTACAGCGCACTTCTTTCG-3′。引物由生工生物(上海)工程股份有限公司合成。

1.2.2 病料DNA提取 取适量肝脏、脾脏、淋巴结病料，加入适量的PBS后用组织研磨器进行研磨，5 000 r/min离心2 min，取上清液，根据病毒DNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA，选取PCV2检测为阳性的样品DNA，-20 ℃保存备用。

1.2.3 PCV2全基因扩增及克隆 PCR反应体系50 μL：2×TransTaqHiFi PCR SuperMix 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板4 μL，ddH2O补足体系。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，根据胶回收试剂盒说明书回收目的片段。回收的目的片段与pMD18-T载体连接，连接体系15 μL：pMD18-T载体0.5 μL，Solution Ⅰ 5 μL，回收产物9.5 μL。4 ℃连接12～16 h。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，取200 μL菌液均匀涂布在含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37 ℃培养12～16 h，挑取单克隆菌落接种到含氨苄青霉素的LB肉汤培养基中，37 ℃摇床培养12 h，进行菌液PCR鉴定，将鉴定为阳性的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.4 PCV2全基因核苷酸序列比对与遗传进化分析 从GenBank中选取不同国家和地区的不同基因型的PCV2毒株全基因组序列(表1)，利用DNAStar中的MegAlign软件对本研究的4株PCV2毒株与GenBank中PCV2参考毒株进行核苷酸和氨基酸序列相似性比对；利用Mega 5.0软件进行遗传进化分析，采用Neighbor-Joining(NJ)法构建系统进化树。

表1 PCV2参考毒株全基因组序列信息

续表

1.2.5 PCV2 ORF2氨基酸序列比对及Cap蛋白抗原指数分析 使用DNAStar中MegAlign软件将GD-1、GD-2、GD-3和GD-4毒株ORF2基因编码的氨基酸序列与国内外17株参考毒株进行比对，分析氨基酸序列相似性；使用DNAStar中Protean软件的Anligenicily Jameson-Wolf方法，预测4株PCV2毒株Cap蛋白抗原指数，并与4株疫苗株(ZJ、SH、LG和DBN-SX07-02)的Cap蛋白抗原指数进行比对分析。

2 结 果

2.1 PCV2全基因组扩增结果

以PCV2阳性病料基因组为模板进行PCV2全基因扩增，1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示，在约1 770 bp处出现特异性目的条带(图1)，与预期结果相符。胶回收目的条带，连接到pMD18-T载体后，阳性菌液测序结果显示，4株PCV2全基因组序列长度均为1 767 bp。

2.2 PCV2全基因核苷酸序列比对与遗传进化分析

运用DNAStar和Mega 5.0等生物信息学软件，将获得的4株PCV2分离株与国内外54株PCV2参考毒株进行核苷酸序列比对及遗传进化分析，结果显示，4株PCV2广东分离株之间的核苷酸相似性为97.7%～99.1%，与国内外54株参考毒株的相似性为91.7%～99.8%，其中与PhuTho/G40312/2018株(Viet Nam，登录号：LC602996)、QZ1410株(江苏，登录号：MG732832)和GXBB1501211株(广西，登录号：MH756609)等亲缘关系最近；经遗传进化分析显示，4株分离株均属于PCV2d基因型(图2)。

2.3 PCV2 ORF2氨基酸序列比对分析

GD-1、GD-2、GD-3和GD-4的ORF2均编码233个氨基酸。利用Mega 7.0将4株PCV2分离株Cap蛋白与国内外17个参考毒株进行氨基酸序列比对，结果显示，4株PCV2分离株Cap蛋白氨基酸序列相似性为97.0%～99.6%；与参考毒株ORF2编码氨基酸序列的相似性为81.5%～100%(图3)。对广东分离株ORF2氨基酸位点分析发现，部分分离株发生了氨基酸位点的变化(图4)。在Cap蛋白B细胞表位区发现7个特异性突变位点：Y3C、F8Y、T56S、R116K、V123I、K164E及R169G；在T细胞表位区发现1个特异性突变位点：T216A。唯一的1个糖基化位点(143-145位氨基酸处)相对保守，均为NYS。

M，DL2000 DNA Marker；1，阴性对照；2～5，GD-1、GD-2、GD-3、GD-4株全基因组PCR扩增产物M，DL2000 DNA Marker;1，Negative control;2-5，PCR amplification products of whole genome of GD-1，GD-2，GD-3 and GD-4 strains，respectively图1 PCV2全基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of PCV2 whole gene

2.4 PCV2 Cap蛋白抗原指数分析

应用Protean软件中的Anligenicily Jameson-Wolf方法对广东分离株的Cap蛋白与4株疫苗株进行抗原指数分析，结果显示，广东分离株的Cap蛋白抗原指数与4株疫苗株的抗原指数差异较大，其部分分离株的抗原指数明显高于疫苗株，主要集中在C-端，在7-12、47-53、80-90、160-170和205-213位氨基酸处与疫苗株存在差异，与ZJ疫苗株差异较小(图5)。

图2 PCV2核苷酸序列系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of nucleic acid sequences of PCV2

图3 PCV2 Cap蛋白氨基酸序列相似性比对Fig.3 Similarity alignment of amino acid sequence of PCV2 Cap protein

图4 PCV2 Cap蛋白氨基酸序列分析Fig.4 Amino acid sequence analysis of PCV2 Cap protein

图5 PCV2 Cap蛋白抗原指数预测Fig.5 Prediction of PCV2 Cap protein antigen index

3 讨 论

1998年首次在患PMWS的病猪身上分离出PCV2，其临床症状表现为体重减轻、呼吸困难、肉芽肿性间质性肺炎、肝炎和肾炎等[16-17]。PCV2可导致猪的免疫抑制作用，降低免疫力，在临床中常与其他病毒或细菌混合感染[18]，被称为最具破坏性的病毒性疾病之一[19]。2000年，PCV2首次在中国被报道[20]，随后，Liu等[21]综合整理2015-2019年间已报道的各地区PCV2流行情况，发现PCV2总流行率为46.0%，其中东北地区最高；PCV2流行率最高的是保育猪(50.9%)；集约型农场和粗放型农场PCV2感染率分别为50.1%和37.5%，这些结果表明PCV2在中国猪群中有较高的感染率，必须采取有效的防控措施。

PCV2具有较高的基因突变率，从而造成该病毒基因型的多样性[22]，其中，PCV2a、PCV2b和PCV2d在世界各地均有较高的患病率，并常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒和猪瘟病毒混合感染[23-24]；PCV2c、PCV2e和PCV2f的患病率较低，且被认为无致病性；中国对PCV2g和PCV2h这2种基因型研究甚少[25-26]。21世纪初，PCV2a是临床感染猪中最流行的基因型，之后发生了2次基因型转移，即从PCV2a到PCV2b的转移及PCV2b到PCV2d的转移[27]，而PCV2d已成为中国近年来流行的主要基因型[25-28]。本试验采集2020-2021年广东省部分地区临床症状呈现PMWS特征的发病猪的病变组织，最终分离到4株PCV2，分别来自韶关市(GD-1)、茂名市(GD-2)、佛山市(GD-3)和江门市(GD-4)，通过全基因组遗传进化分析显示，4株分离株均为PCV2d型，说明广东省部分地区主要流行亚型为PCV2d型，提示广东省应加强对PCV2d基因型病毒的防控。

PCV2d基因型Cap蛋白序列中含有7个独特的氨基酸(53I、59K、68N、89L、90T、134N及169R)，这些氨基酸大多沿病毒Cap表面分布。研究发现，如果表位中有1个氨基酸发生突变，那么突变后的病毒将不能被表位s抗体识别[29]。对PCV2 ORF2氨基酸分析显示，4株分离株Cap蛋白氨基酸序列的相似性为97.0%～99.6%；与参考毒株ORF2编码氨基酸序列的相似性为81.5%～100%。在Cap蛋白B细胞表位区发现7个特异性突变(Y3C、F8Y、T56S、R116K、V123I、K164E、R169G)，T细胞表位区发现1个特异性突变(T216A)，这些突变位点可能是病毒致病性改变的原因，也可能是目前疫苗免疫效果不佳的原因之一。由于Cap蛋白是PCV2重要的结构蛋白，能刺激机体产生中和抗体，同时也与致病性有关[11]。因此，这些氨基酸的变异是否会造成这4株PCV2d的抗原性和致病力的增强，有待进一步研究。

本研究将分离到的4株PCV2的Cap蛋白与4株疫苗株进行抗原指数分析，结果显示，与SH、LG和DBN-SX07-2疫苗株相比，4株广东分离株在7-12、47-53、80-90、160-170和205-213位氨基酸处差异较大，可能会影响疫苗对动物的保护效果，而与ZJ疫苗株差异较小。因此，广东地区可考虑选用ZJ疫苗株进行接种，免疫效果可能比其他疫苗株更好，从而降低PCV2给养猪业带来的经济损失。PCV2在中国养猪业危害较广，且具有较高的基因突变率，因此，对PCV2流行情况进行持续性监测变得十分重要。本研究对广东省部分地区PCV2全基因进行遗传进化分析，为广东省PCV2疾病防控及疫苗毒株的筛选和研发提供了参考依据。

4 结 论

从广东省部分地区分离的4株PCV2均为2d亚型，其Cap蛋白氨基酸序列存在多个突变位点，抗原指数与疫苗株差异较大，提示广东省PCV2的流行趋势逐渐以2d亚型为主。