MicroRNA的生成、检测与功能研究进展

解举民，王雅雯，黄玉迪，谢小林

(1.湖北理工学院 a.医学院，b.肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 黄石 435003；2.黄石市精神病医院 医务科，湖北 黄石 435000)

MicroRNAs (miRNAs)是一类长度为18～24个核苷酸的内源性非编码小分子RNA，参与生物体发育、细胞分化、细胞增殖及凋亡、细胞变异与癌化等多种生理过程。MicroRNAs通过与互补的mRNAs结合抑制蛋白产生，参与靶基因调控，具有组织特异性和阶段特异性[1]。某些miRNAs控制动植物的发育，执行特定的生物学功能，在病毒、肿瘤中存在许多调控靶点，可能成为多种疾病的标志物，对疾病的预防、诊断、预后检测具有重要的临床意义[2]。成熟microRNAs具有序列短、稳定性差、表达量低等特点，致使microRNAs的检测难度大[3]。

1 MicroRNA

1.1 MicroRNA的发现

1993年，Victor ambros，Rosalind lee和Rhonda feinbaum发现线虫体内有一种不编码蛋白质的RNA分子，长度为22 nt，可以通过抑制核蛋白lin-4基因表达，调控线虫的生长发育。研究发现，该小分子非编码RNA序列与lin-4 mRNA的3’UTR(Untranslated Regions, UTR)区序列互补并抑制lin-4蛋白合成[4]。继发现lin-4之后，科学家又发现了let-7，不同的是其调控晚期幼虫转化为成虫，二者被命名为小时序RNA (small temporal RNA，stRNA)[5]。

Sanger研究所的科学家于2002年成立了microRNA Registry数据库，后更名为miRBase，其中的microRNA数量逐年增多，microRNA成为研究领域的热点[6]。

1.2 MicroRNA的生物合成过程

一部分miRNA位于内含子区域，与宿主基因同用启动子和调控元件，另一部分miRNA有独立的转录本。pri-miRNA是miRNA的前体，通常是含有茎环结构的初始转录本。动物体内的pri-miRNA在细胞核中经过Drosha和辅助因子Pasha作用，转化为60多nt的发卡状前体miRNA(pre-miRNA)[7]，再由exprotin5将其运至细胞质，由Dicer切割为20多nt的双链miRNA，再降解为成熟的单链miRNA，与Argonaute(AGO)蛋白组成沉默复合体(RISC)，引起靶mRNA的降解或者翻译抑制[8]。RISC结合的一条链的5’端相对不稳定，为了便于区分，会在miRNA的序号后加上-5p或-3p[9]。

植物中的miRNA序列与动物体内的miRNA很少同源，在RNAseⅡ作用下形成茎环结构的pri-miRNA，其长度为70～300 nt，进而在类Dicer酶DCL1作用下形成per-RNA，(动物体内长度为65～70 nt，植物的长度可达数百nt)，继而形成双链miRNA。miRNA甲基转移酶HEN1对这些miRNA最后一个核苷酸的核糖进行甲基化。有研究表明，miRNA的错误表达会导致植物的各种缺陷，在miRNA的生物过程中，lariat RNAs是pre-mRNA剪切过程中产生的副产物，影响miRNA的稳态调节，lariat RNA通过充当诱饵和隔离复合体的方式来阻止miRNA的加工。

1.3 MicroRNA的作用机制

动物miRNA与RISC复合体结合后，就可对基因产生调控作用，miRNA通过5’端的种子序列第2～8位核苷酸识别靶基因mRNA3’-UTR的调控原件，同RISC复合体一起发挥作用，miRNA靶向调控超过5 300个人类基因，占人类基因的30%[10]。在动物细胞中，若miRNA与靶mRNA完全匹配，则mRNA降解；若部分匹配，则通过抑制靶mRNA的翻译过程来沉默基因，抑制蛋白质合成，但不影响mRNA合成[11]。在植物中，miRNA与靶mRNA是完全互补的，从而导致靶mRNA的降解，但结合位点不是3’UTR，而是在开放阅读框(open reading frame, ORF)中[12]。

miRNA的作用机制分为翻译抑制和mRNA降解2种途径。翻译抑制机制中的GW182蛋白，通过N端的GW结构域与AGO结合、C端的沉默结构与其他辅助蛋白(如PABP等)结合来抑制翻译。这些结合蛋白一方面会在转录之前抑制40S核糖体小亚基和60S核糖体大亚基结合成80S的核糖体，翻译起始过程被抑制，另一方面在翻译过程中会阻止核糖体的延伸，从而终止翻译。

miRNA抑制翻译起始有3种机制：一是抑制核糖体的组装，进而阻止翻译起始，如内源性let-7微核糖核酸蛋白(miRNPs)或(AGO)蛋白与mRNA联合抑制翻译起始过程；二是抑制靶mRNA m7G帽子的存在，抑制起始复合物的形成；三是抑制polyA 结合蛋白poly A binding protein (PABP)与mRNA结合，影响翻译起始，含有AGO蛋白和GW182的let-7 miRNPs减弱了5’-cap和3’-poly(A)对翻译过程的协同增强作用，从而抑制翻译。miRNA抑制mRNA与核糖体偶联的内部核糖体进入位点(IRES)来发挥抑制作用，说明有些抑制过程不是发生在翻译起始阶段。此外，miRNA沉默作用还可以发生在其他阶段，例如let-7a miRNA在HeLa细胞中调控mRNA的翻译过程，let-7a miRNA和miRISC蛋白AGO抑制核糖体的翻译[13]。

mRNA的切割需要miRNA与靶基因完全匹配。然而，在动物体内种子序列之外，这种匹配度却不高，哺乳动物的4种AGO蛋白中，AGO2具有包裹miRNA并与靶基因结合切割mRNA的作用[14]。mRNA的降解是miRNA结合到mRNA的3’-UTR或5’-UTR或CDS区上，但在5’-UTR上的结合可能会使转录起始因子或核糖体进入mRNA，反而会激活转录。miRNA的抑制和mRNA的降解可能是先后发生的，有研究发现，miRNA抑制的mRNA并不是立即被降解，而是先聚集在p小体(p-body)中，当需要重新启动这些mRNA时，则会从p小体中释放，翻译蛋白质，若不需要就会在核糖体中彻底降解[15]。

2 MicroRNA的检测方法

当前microRNA的检测方法主要有8种，分别为：Northern blotting、实时荧光定量PCR、微阵列法、RAKE、指数扩增、滚环扩增、纳米粒和酶辅助目标核酸分子再循环法。

3 MicroRNA的功能

3.1 MicroRNA的跨界调控

植物microRNA的跨界调控最早于2011年发现。研究表明，miRNA-168a可与人/小鼠低密度脂蛋白受体适配器蛋白1 (LDLRAP1) mRNA结合，抑制肝脏中LDLRAP1的表达，从而降低小鼠血浆中LDL的去除。这说明植物miRNA可以调节哺乳动物靶基因的表达[16]。

MIR2911是一个金银花(honeysuckle flower, HS)编码的非典型microRNA。生物信息学预测和荧光素酶报告试验表明，MIR2911可以靶向多种甲型流感病毒(IAV)，包括H1N1，H5N1和H7N9。实验发现MIR2911显著抑制了H1N1编码的PB2和NS1蛋白的表达，表明MIR2911是中药中发现的第一个直接针对各种IAVs的活性成分，进一步验证天然产物可以有效地抑制病毒感染[17]。

利用植物源人工microRNAs (amiRNAs)治疗HBsAg /HBsAg转基因小鼠，在莴苣中表达2条针对HBV表面抗原基因(HBsAg)的沉默RNA序列siR471和siR519，发现莴苣水煎剂对HBsAg基因表达有明显的抑制作用，长期饲喂HBsAg /HBsAg转基因小鼠，发现肝脏损伤减轻，且无毒副作用。利用植物内源性miRNA的生物发生机制来产生药用siRNA是解决siRNA稳定性问题和减少RNAi治疗潜在副作用的一种新方法。植物来源的miRNA可作为一类新的生物活性成分在哺乳动物体内产生疗效，为人类疾病治疗提供新思路。

3.2 病毒microRNA的调节功能

首个病毒编码的miRNA是在2004年EB病毒(EBV)感染的细胞中被发现，并确定了病毒调节宿主和/或病毒基因表达的调节因子。成熟的miRNA通过RISC的方式调节细胞生理功能[18]。目前，发现EBV编码25种前体miRNAs切割产生44种成熟miRNAs，分别由BART(BamH1-A region rightward transcript)和BHRF1(BamH1 fragment H rightward pen reading frame1)基因编码。研究发现，在鼻咽癌患者中，miR-10b基因通过LMP1，Twist1进行基因调控，过表达miR-10b使鼻咽癌细胞增殖和迁移，诱导上皮-间质转化(EMT)，也有临床研究发现鼻咽癌患者血清中EBV编码的microRNA BART2-5p表达增高，通过抑制RND3，BART2-5p激活了Rho信号转导，增强细胞运动性，EBV microRNA BART2-5p在促进鼻咽癌转移中具有新作用。这些已经成为鼻咽癌转移及其预后指标或作为治疗鼻咽癌的新靶点。

在EBV发现之后，陆续发现了许多病毒编码的microRNA，如疱疹病毒(Herpes simplex virus, HSV)中，HSV-1(miR-H1)，KSHV(miR-K12-3-3p)和3种先前鉴定的病毒miRNA (v-miRs)。v-miRs既可以调节宿主功能又具有病毒治病功能，可能参与炎性口腔疾病[19]。轮状病毒(Rotavirus,RV)是引起婴儿病毒性腹泻的主要原因[20]，乙型肝炎病毒(Hepatitis A Virus, HBV)，HBV编码的HBV-miR-3靶向其转录本来调控自我复制的过程[21]。

3.3 MicroRNA在乳腺癌中的作用

miRNA通过不同的细胞通路，发挥致癌基因或抑癌基因的作用，miRNA-206是最早发现与乳腺癌相关的miRNA。其通过对EVI-1的负调控来抑制乳腺癌细胞的增殖，在人乳腺癌细胞株MCF-7和T47D中下调miRNA-206的表达会使ER-α阳性乳腺癌细胞对三苯氧胺的敏感性增加，增强治疗效果。研究表明，转染miR-206后，三阴性乳腺癌(TNBC)MDA-MB-231细胞中TM4SF1的表达下调，影响细胞迁移和侵袭，可成为TNBC的潜在治疗药物[22]。miRNA-206在肿瘤细胞中表达比在正常细胞中的高，通过与全长神经激肽-1 mRNA的3’-UTR结合来影响蛋白表达。miRNA-206的高表达促进了乳腺癌细胞的侵袭、迁移、增殖和病原灶形成[23]。

MicroRNA-34c (miR-34c)在乳腺癌转移过程中表达量较低，过表达miR-34c后，可抑制MCF-7和MDA-MD-231乳腺癌细胞的转移过程。miRNA-99a通过与FGFR3 mRNA 3’UTR结合沉默FGFR3，抑制乳腺癌细胞的生长发育，miR-99a在乳腺肿瘤中下调后，FGFR3在乳腺肿瘤中的表达显著上调。miR-21通过靶向与凋亡、增殖和转移相关的多个抑癌基因，在人类的许多恶性肿瘤中发挥重要作用，其表达会影响乳腺癌耐药性的发生[24]。

4 总结

作为RNA领域研究热点的microRNAs，通过多种方式调控靶基因表达，参与机体生长发育的各个阶段以及细胞内的多种生理过程，是重要的基因表达调控方式之一。游离于细胞外的microRNAs能稳定存在于血清中作为疾病(特别是癌症)，发生、发展和诊断的标志物，具有操作简便、高灵敏度、高通量、可控性好、范围广、特性识别等优点。及早检测，早发现，早治疗，可以有效地预防癌症扩散。植物源microRNAs通过消化吸收或注射的方式进入动物机体后，可以实现跨界调控。这一发现极大地改变了当前疾病治疗的界限，拓宽了疾病治疗手段，为疾病的诊疗提供了新的方法。