基因编辑技术在我国畜牧业的研究进展

张格阳 张子敬 翟亚莹 吕世杰 朱肖亭 朱进华 李峥 于翔 王红利 施巧婷 闫祥洲 王二耀*

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南郑州 450002；3.河南农业大学动物科技学院，河南郑州 450008；4.河南省动物检疫总站，河南郑州 450000；5.河南省郏县红牛产业发展中心，河南平顶山 467100）

基因编辑（geneediting）简单讲是通过对基因进行定点修饰、定位敲除以及插入目的基因片段来改变其特征和功能的技术。目前，锌指核酸内切酶（zincfingerendonuclease，ZFN）、类转录激活因子效应物（transcriptionactivator-likeeffectornucleases，TAL ENs）和新型基因编辑技术CRISPR/Cas9 系统是3 种主要基因编辑技术。近年来，基因编辑技术取得了喜人的进展，被越来越多的人熟知和关注。除了广泛应用于人类生命科学研和及临床应用外，在畜牧业也有应用。

畜牧业作为支撑我国农业经济的支柱之一，不仅是实现经济繁荣的重要内容，也是发展生态农业的关键途径。高效精准的基因编辑技术为研究家畜的疾病机制和培育良好品质品种家畜提供了强有力的“武器”。在治疗家畜疾病方面,通过特定基因编辑技术在DNA 水平上使用能良好表达的基因来替换或补偿致病基因突变，抑或是切除致病性基因,从而达到治疗疾病的目的。在家畜遗传育种方面，与传统育种方式不同，在有一定安全性保障的同时，根据人们的不同需求，借助基因编辑技术在指定位置对基因实施定点编辑。一方面极大缩短了育种时间，另一方面也降低了育种过程中的人力、物力、财力成本[1]。

1 主要基因编辑技术

1.1 锌指核酸酶（ZFN）技术

锌指核酸酶（ZFN）：由DNA 识别域锌指蛋白（Zinc-Finger Protein，ZFP）（负责识别）与DNA 切割域限制性核酸内切酶FokI（负责切割）构成。

机理：ZFN 作为人工合成的限制性内切酶通过其锌指DNA 结合域、DNA 切割域发挥作用。研究者通过改造DNA 结合域，靶向定位于不同的DNA 序列，再由DNA 切割域进行特异性切割。此外，ZFN 技术还可与细胞内DNA 修复机制共同发挥作用，使研究者自由编辑基因组。

锌指核酸酶（ZFNs）在基因靶向修饰方面起到促进作用，尽管如此，为了弥补锌指基序与其靶序列间缺乏特异性缺陷，构建大型文库用来筛选能与靶点序列特异性结合的锌指蛋白是必不可少的步骤。与此同时，该技术的弊端还有易脱靶、细胞死亡、额外突变等[2]。

1.2 类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）技术

类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）：TALEN 为第二代基因组编辑核酸酶。TAL 效应因子（TALE）可以特异性结合目的序列，通过将一段人造TALE 与FokI 核酸酶连接起来，即组成了TALEN，一类具有特异性基因组编辑功能的强大工具。

与ZFNs 技术相比，因为TALEN 具有高度特异性，能与DNA 靶位点结合，大大降低了功能蛋白脱靶的几率。并且与ZFNs 相比，TALEN 具有灵活性强、操作简便、构建更便捷、脱靶效应和细胞毒性低等优势。但装配TALEN 模块是一个高强度、费时、费力的过程。

1.3 CRISPR/Cas9 系统

CRISPR 序列由众多短而保守的重复序列（repeats）和间隔区（spacer）组成。间隔区是一些可变序列，其与先前入侵细菌基因组外的外源遗传物质的序列相对应。这些间隔序列储存在细菌基因组内，被看作是通过再感染来触发降解入侵病毒DNA 的记忆机制。

机理：①具有核酸酶活性的Cas9 蛋白质在sgRNA 引导下特异性地识别原间隔序列的相邻序列。②Cas9 蛋白质到达目标DNA 的指定部位后，发挥核酸酶作用，切断DNA 双链，引起双链断裂（double-strandbreak，DSB）。③双链dna 盾断裂后启动细胞自我复原系统，利用非同源末端的连接复原（non-homologous end-joining，NHEJ）和同源重组修复（homology dependent repair，HDR）两种方式的基因修复。研究人员可以导入外源基因，通过同源重组将目标基因重组为目标基因，并通过在接收细胞中表达外源基因来进行基因编辑。

CRISPR-Cas9 技术优势在于构建和使用时非常简单、方便和低成本，使用它可以用来同时瞄准多个基因的优势，可以逐条甚至批量检测人类或动物基因组中的基因表达和互做情况,以明确基因的功能及调控网络。但易脱靶一直是CRISPR-Cas9 技术亟待解决的问题。

2 基因编辑技术在畜牧业上的应用

基因编辑技术为畜牧业发展做出了极大贡献。在改良生产性能方面，基因编辑技术通过改造动物基因组，大力改良畜禽经济性状，加快生长速度，提高饲料利用率等。在改善肉质方面，为达到人们对肉质的需求，基因编辑方法既可以降低动物脂肪量，也可以降低其肌肉质量；在提高家畜抗病力方面，开发具有抗药性的新物种，增加动物基因适应性，减少抗生素使用，促进人类健康和环境保护的研究；在构建疾病模型方面，转基因动物的应用既能开发人类疾病模型，也有助于理解疾病的运作机理和治疗方法。

2.1 猪

全世界第一例POSA26 定点基因敲入猪模型来源于2014 年Li 等采用了TALEN 介导的基因敲入技术获得的结果[3]。赖良学等开发了ZFN 和TALEN 靶向技术，并将其应用于猪基因组修饰中[4]。该研究小组通过ZFN 获得了PPARγ 基因敲除猪。研究小组又使用TALEN 技术将一对外来loxp 引入猪基因组的ROSA26 位点，可以将任意的基因通过重组酶介导插入到ROSA26 的位点处，并且在猪组织中实现目标基因的无差异表达。Yang 等用ZFN 技术分别得到敲除GGTA1（α 1,3-galactosyltransferase）基因和PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma）基因的克隆猪，并且在原代细胞中观察到双等位基因失活的比率达到1%，这比之前同源重组的打靶效率高10000 倍[5]。中国科学院动物研究所周琪等研究团队构建了CRISPR/Cas9 系统，利用“一步法” 直接将切割v WF 基因的CRISPR-Cas9 系统注射到猪受精卵中，该方法非常便利、安全和高效[6]。研究发现，敲除猪以及相应的宿主细胞中CD163 全蛋白或者是病毒互相作用的SRCR5 区基因，可以使其对I 型和II 型的PRRSV 分离株产生抵抗力。2018 年，华南农业大学吴珍芳带领的团队将CRISPR/Cas9 基因编辑技术与体细胞核移植（Somatic Cell nuclear transfer，SCNT）相结合，获得了一头敲除CD163 基因的杜洛克猪[7]。2018 年，研究人员利用CRISPR/Cas9 将靶向非洲猪瘟（ASFV）磷蛋白p30（ASFV-p30）导入病毒体内，结果发现，由ASFV 引起的空斑完全消失，且毒力下降4 个数量级。2014 年，Hai 等通过卵显微注射和CRISPR/Cas9 系统组合的办法成功获得血管性血友病因子（vWF）双等位基因敲除的小型猪[8]。Yu 等利用CRISPR/Cas9 技术获得了可用于研究杜兴氏肌肉营养不良症（Duchenne Muscular Dystrophy，DMD）基因敲除肌营养不良症疾病模型[9]。Zhou 等采用显微注射技术，分别将猪酪氨酸酶基因、PARK12 基因以及PINK1 基因的gRNA 和Cas9 调至猪成纤维细胞中，顺利获得敲除这些基因后的纯合子细胞[10]。并且把经人工筛选出来的敲除酪氨酸酶基因纯合子当做供体，经由体细胞核移植后得到因敲除酪氨酸酶基因本应为黑色的表现为白的版纳猪。研究人员利用CRISPR/Cas9 技术也在猪成纤维细胞中成功进行了肌肉生长抑制素基因敲除，为建立基因敲除的克隆猪和新猪种培育打下了基础。2015 年，Cui 等利用ZFNs 技术成功敲除了猪的生长激素受体（growth hormone receptor，GHR）基因，该试验为进一步研究人类侏儒综合征提供了理想的动物模型[11]。

2.2 牛、羊

张存芳研究表明，利用ZFN 技术将双链断裂（double-strand break，DSB）引入羊肌肉生长抑制素（MSTN）基因，诱导细胞自身固有的非同源末端（non-homologous end-joining，NHEJ）修复途径提高MSTN 基因敲除效率，为通过胚胎工程手段获得产肉性能高的转基因家畜奠定基础[12]。利用ZFN 在牛中高效产生MSTN 双等位基因突变[13]。

MSTN 属于TGF-β 超家族，抑制肌肉细胞生长。Luo 等利用组装后的ZFN 来破坏编码肌肉生长抑制蛋白的牛MSTN 基因，同时又采用ZFN 技术诱导基因靶向策略，突变频率约为20%，双等位基因突变效率为8%，通过SCNT 成功获得了来自黄牛的MSTN 基因靶向成纤维细胞克隆牛[13]。在牛、山羊和猪的细胞基因中导入特异的自然突变体和单核苷酸多态性（SNP），是Tan 等在2013 年利用TALEN 技术和同源重组做的研究，如把Celtic 牛的无角基因POLLED 导入有角的奶牛，将猪、羊的Pc、GDF8、p65 和LDLR基因引入SNP 等[14]。

选定以山羊成纤维细胞进行试验后，Ni 等以山羊MSTN 基因、核孔蛋白（NUP）基因、病毒蛋白（PrP）基因以及β-乳球蛋白（BLG）基因为对象设计了gRNAs，并且依据CRISPR/Cas9 技术同时编辑了4个基因，敲除细胞双等位基因MSTN 后，又经过体细胞核移植手段成功获得基因敲除后的山羊后代[15]。中国农业大学呼锐利用CRISPR/Cas9 技术将Cas9 mRNA 和sgRNA（Single Guide RNA）注射到原核，成功生产出FGF5 基因敲除羊[16]。

3 基因编辑技术的发展与应用前景

基因编辑技术解决了家畜育种周期长和遗传资源少等问题，大大缩短了育种周期，降低育种成本，迅速增加了遗传多样性。有了基因编辑技术的加持，畜禽基因功能的研究和转基因育种变得更加高效。基因编辑技术弥补了传统转基因技术的整合随机、遗传不稳定等缺陷。基因编辑技术前景广阔，特别是CRISPR/Cas9 技术因为其简单、高效、成本低等原因，越来越多地被研究人员认可、使用。采用基因编辑技术，我们也可以进行以下研究和应用：①基因遗传功能和控制方面的基本生物研究；②为提高畜禽生产能力或者质量而进行的转基因育种；③转基因生物反应器；④抗病育种；⑤人类疾病的转基因模型；⑥作为异质器官移植的供体。

基因编辑技术正在迅速发展，其缺陷也正在被研究和攻克。总有一天，基因编辑将极大促进转基因技术在畜牧领域的应用。