低氧环境下VEGF及其受体的造血调控作用及机制研究进展*

李治材 肖军 李翠莹

低氧是一个常见的不利环境因素，机体通过调节各种应激因子以抵抗这种环境所带来的影响。低氧诱导因子（hypoxia inducible factors，HIFs）是最主要感受低氧的转录因子，主要包括HIF-1α和HIF-2α，通过调控其下游靶基因EPO（促红细胞生成素）、VEGF、血管内皮生长因子受体1（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR-1，又称fms样酪氨酸激酶1，Flt-1）、血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor2，VEGFR-2，又称胎肝激酶1，Flk-1，又称KDR）的表达，增加红细胞生成和血管生成以改善组织缺氧。然而，长期处于低氧环境，会引起红细胞的过度增生，导致血液黏度增加，血液动力学改变，反而加重低氧。一般认为，EPO是调控低氧环境下红细胞生成的重要因素，其对低氧下红细胞过度积累发挥着至关重要的作用。然而，近年来，越来越多的研究发现EPO与红细胞生成并不完全相关，EPO也无法解释所有的红细胞生成增加[1]；VEGF是一种与血管生成和造血密切相关的生长因子，涉及Ras/MAPK、PI3K-AKT、Stat3等与细胞增殖分化相关的多条信号通路，VEGF及其受体VEGFR-1、VEGFR-2的过度表达常常与异常造血有关[2]。因此，本文对低氧条件下VEGF在造血中的作用进行梳理和阐述，以期望对低氧和造血相关疾病提供更丰富的认识和更多的治疗思路。

1VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2的结构功能及表达

1.1VEGF及其受体VEGFR-1、VEGFR-2的结构与功能：VEGF是一类分泌性糖蛋白，包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE和胎盘生长因子（plasma placental growth factor，PLGF）等成员。其中，关于VEGFA的研究是最广泛的，VEGFA是一个分子质量在34-42KD，由反平行多肽构成的同源二聚体，中间由两个二硫键连接。VEGFA根据不同的剪切形式又可形成不同的亚类，如VEGFA121、VEGFA165、VEGFA189、VEGFA206等，其中VEGFA165是人体内含量最多分布最广泛的亚类[3]。研究表明，VEGF主要是通过与其受体结合后进行相应信号转导而发挥促进造血的作用。与VEGFA结合的主要是VEGFR-1和VEGFR-2，它们同属于典型的Ⅲ型酪氨酸激酶受体，由一个（Ig）同源结构域组成的胞外区、一个跨膜结构和一个裂解酪氨酸激酶结构域；VEGFA与其受体Ig样结构域结合，使受体的酪氨酸激酶结构域构象发生改变，受体被激活，底物蛋白发生磷酸化，激活下游的Ras/MAPK、Stat3、PI3K/AKT等信号转导途径，影响细胞增殖、分化，在一些血液系统恶性增殖性疾病中，如淋巴瘤、白血病等，异常肿瘤细胞VEGF、VEGFR-2表达升高。此外，VEGFR-1、VEGFR-2在体内还存在可溶型（sVEGFR）形式，通过拮抗VEGF，降低VEGF水平，抵抗血管生成和造血[4]。

1.2VEGF及其受体VEGFR-1、VEGFR-2与低氧的关系：VEGF是公认的血管生成因子，其产生主要受HIFs的调节。HIFs是一种调节细胞低氧反应的核心氧感受因子，由功能亚基（HIF-1α、HIF-2α）和调节亚基（HIF-β）共同参与低氧应答。常氧条件下，HIF-α被脯氨酰羟化酶（PHD）羟基化，然后与肿瘤抑制因子（VHL）结合，最终被泛素化降解；低氧条件下，PHD活性受到抑制，HIF-α进入细胞核与HIF-β形成二聚体，结合低氧反应元件（HRE）调节靶基因的表达，HIF-1α与HIF-2α有着部分共同的靶基因，但其在低氧下对这些靶基因的调控却又相互独立。目前认为，VEGF主要受HIF-1α调控，而VEGFR-1、VEGFR-2则主要受HIF-2α调控[5-6]。HIF-1α在低氧早期以及严重缺氧时活性最高，通过与靶基因VEGF、EPO转录相关区域结合启动最初的低氧反应。而在慢性缺氧条件下是由HIF-2α调节下游基因EPO、VEGFR-1、VEGFR-2的表达[7]。

2血管内皮生长因子及其受体与造血

2.1骨髓内皮细胞在造血中的作用：骨髓内皮细胞是骨髓造血微环境的重要组成部分，骨髓内皮细胞和血管周围细胞共同构成血管周生态位，通过表达白细胞介素-6（interleukin6，IL-6）、干细胞因子（stem cell factor，SCF）等因子调控造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）、造血祖细胞（hematopoietic progenitor cells，HPC）的自我更新和分化[8]。研究证明造血重建与内皮细胞的再生有关，骨髓内皮细胞可以产生多种细胞因子并支持人体外CD34阳性细胞的增殖和分化，注射自体或者异源的内皮细胞可以促进放射清髓后的造血干细胞恢复和重建[9]。在体内，骨髓内皮细胞表达HSC维持和再生所需的生长因子，包括SCF、趋化因子CXCL12和多效生长因子（pleiotrophin）[10]，从内皮细胞中条件性敲除这些因子会使骨髓中的HSC明显减少，在慢性骨髓增生性肿瘤中发现携带JAK2V617F基因突变的内皮细胞与异常造血相关，并能增加患者骨髓HSPC对辐射的耐受性[11]。VEGFR-2存在于血管内皮细胞，对内皮细胞功能的发挥非常重要，VEGFR-2阳性的血窦内皮细胞被认为是放疗后造血干细胞恢复所必需的，HOOPER等发现骨髓血窦内皮细胞表达VEGFR-2，内皮VEGFR-2缺失的小鼠在接受全身辐照后骨髓血管再生和造血恢复受到明显抑制，注射VEGFR-2抗体也可以抑制造血干细胞的恢复[12]。此外，骨髓的内皮功能也会受到其他因素的影响，进而影响造血；心血管方面的疾病如高血压、动脉粥样硬化、心肌梗死等会引起骨髓内皮功能障碍、渗漏，重塑血管骨髓生态位，刺激造血和炎性白细胞的产生[13-14]，HEYDE等也同样发现动脉粥样硬化患者HSC、髓系共同祖细胞增殖率明显升高[15]。以上研究表明，骨髓内皮细胞对造血的维持是必不可少的，内皮细胞影响骨髓造血。

2.2血管内皮生长因子及其受体在胚胎造血中的作用：胚胎造血发生在氧浓度为1%～5%的子宫内，子代通过胎盘屏障获得的氧气较少，子宫中的生理性低氧环境对胚胎期造血的发育起到决定性作用。低氧环境下，HIF控制着对下游靶基因VEGF、VEGFR-2、TGF-β的表达，敲除HIF-1α基因的小鼠，在胚胎发育E9.5～E12.5会出现心血管、造血系统发育不全而死亡[16]。VEGF及其受体对胚胎造血发育也发挥着重要作用，敲除小鼠VEGF或受体VEGFR-2都会导致胚胎致死，同时伴随着造血发育的异常，VEGF缺乏一个等位基因的小鼠在11 d～12 d之间的胚胎发育过程中缺乏足够的内皮细胞和造血细胞而死亡；纯合VEGFR-2的缺失小鼠在胚胎8.5 d～9.5 d之间死亡，伴随着中胚层造血细胞分化的阻滞，不能迁移形成血岛[17]。最近的研究发现，中胚层前体阶段内皮和造血发育需要VEGF，外源性VEGF有利于造血和内皮标志物的表达[18]。另外，VEGF在胚胎干细胞红系分化方面也有一些发现，CERDAN等诱导胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）分化的研究显示，VEGF的添加特异性增加了红系集落形成单位（erythroid colony forming units，CFU-E）的数量，并促进了SCL/TAL-1基因的表达，在诱导7 d时，表达血型糖蛋白A（CD235a）和CD34的细胞数量高出对照3倍[19]。LIANG等在斑马鱼胚胎发育中观察到，注射VEGF mRNA的斑马鱼胚胎中，VEGFR-2、SCL、GATA1转录物的产生明显增加，血红蛋白染色明显增强[20]。上述研究表明，低氧是胚胎造血发育的重要环境因素，低氧下VEGF促进胚胎干细胞来源的早期红细胞表面标志物的表达以及红系祖细胞的自我更新。

2.3血管内皮生长因子及其受体在成体造血中的作用：骨髓是成体造血的主要器官，由骨髓造血细胞和骨髓微环境构成。骨髓微环境最大的特点就是低氧，其氧浓度仅为1%～6%，低氧环境下细胞HIFs水平增加，有利于骨髓细胞表达VEGF和VEGFR-2，骨髓微环境中VEGF浓度明显高于外周血[21]。VEGF与造血细胞表面的VEGFR结合，直接参与造血调控[22]。在骨髓造血细胞中，CD34阳性造血干/祖细胞表面均表达VEGFR-1和VEGFR-2，而向各系分化后，VEGFR-2表达迅速减少，而VEGFR-1广泛表达于红系前体细胞、单核-巨噬细胞以及巨核细胞表面[23]。目前认为，VEGF内分泌途径对调节HSC存活也有重要作用，VEGF基因敲除后小鼠HSCs的存活率、集落形成能力和增殖率降低，并且使用可溶性VEGFR-1（sVEGFR-1）拮抗VEGF后对HSCs存活率仅有较小的影响，表明内分泌途径能够促进HSCs的存活[24]。在慢性高原病中研究发现，慢性高原病患者骨髓细胞HIF-2α显著升高，骨髓组织和血浆中VEGF的浓度也显著升高，且VEGF与氧饱和度（SaO2）呈负相关，与血红蛋白（Hb）浓度呈正相关[25-26]。SU等研究证实，HIF-2α与骨髓组织VEGF、骨髓单个核细胞（BMMNCs）VEGFR-2的表达呈正相关，VEGFR-2的表达有利于红细胞生成和骨髓微血管形成[21]。

关于VEGF受体的研究表明，VEGFR-1主要与造血干细胞动员、迁移有关，并参与造血重建，药物阻断VEGFR-1表达后，骨髓表现为造血干细胞增殖、分化受抑制，骨髓造血重建失败[27]。小鼠体内实验证实，VEGF缺陷的造血干细胞移植无法重建受到辐射破坏的造血系统，而在体内刺激VEGFR-1完全逆转了这种现象[28-29]。因此，VEGFR-1因此也被证实可参与调节造血干细胞的细胞周期和分化，是促进造血干细胞动员的重要分子。VEGFR-2是VEGF发挥功能的主要受体，在促进造血干/祖细胞增殖、抑制细胞凋亡中起着重要作用。研究发现，成年鼠VEGF缺乏导致HSC数量的大量减少，用VEGF突变体特异性激活VEGFR-2能够提高HSC的存活率，促进其自我更新[30]；近年来有观点认为，VEGFR-2可能是HSC的一个关键性标志，不仅是因为造血细胞起源于造血内皮，更重要的是它具有长期增殖和多向分化的能力[31-32]。已有研究发现表明成体中的内皮祖细胞亦可来源于CD34+VEGFR-2+的细胞群，体外诱导实验表明，CD34+VEGFR-2+细胞群不但能在单细胞水平上产生造血克隆和内皮细胞克隆，而且该细胞群具有长期扩增能力，显示出原始干细胞的典型特征[33]。ZIEGLER等人研究发现，CD34+VEGFR-2+的骨髓细胞是造血干细胞的重要来源，CD34+VEGFR-2阴性的细胞群往往只具有短期造血的功能，VEGFR-2是HSC长期再增殖的关键标志物，因而提出将VEGFR-2作为造血干细胞的重要鉴定指标之一[34]。在造血分化方面，VEGF-A超等位基因杂合小鼠骨髓培养物中观察到CFU-E数量显著升高，并且这种升高能够被VEGFR-2的中和抗体阻断，且VEGF仅对CFU-E的数量和大小有直接的促进作用[35]；在巨核细胞中的研究也证实，VEGFR-2抑制剂可导致巨核细胞标志物表达的显著减少，减少了巨核细胞的分化[30]。以上研究表明，低氧是造血细胞表达VEGF和VEGFR的必要环境，VEGFR对造血干、祖细胞存活、增殖以及造血细胞分化方面产生重要的影响。

2.4血管内皮生长因子及其受体对恶性肿瘤性疾病造血功能的影响：低氧是肿瘤微环境十分常见的现象，低氧环境有利于白细胞介素6、转化生长因子（transforming growth factor，TGF）、血管内皮生长因子等细胞因子分泌，在非小细胞肺癌患者癌组织中HIF-2α、VEGF均明显高于癌旁组织，并且HIF-2α与VEGF之间呈明显的正相关[36]。另有研究发现，VEGF在乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤中均有高表达，肿瘤衍生的VEGF进入循环并作用于内皮细胞和造血细胞以调节血管生成和造血，循环VEGF促进骨髓中VEGFR-1阳性的HSC动员到外周血，并进入脾脏造血，导致肿瘤患者常常伴随着脾大[37]；同时，由于骨髓HSC的数量减少，骨髓造血功能减弱，机体处于贫血状态，而使用抗VEGF药物可显著改善患者的骨髓造血和贫血状况。小鼠中的研究有着同样的结果，在给小鼠植入能产生VEGF的肿瘤细胞14 d后，小鼠骨髓造血细胞减少，外周血VEGF升高并伴随着严重贫血，外周血分析显示血细胞比容显著降低，外周血血红蛋白和红细胞数量显著降低，髓外造血旺盛，肝脾肿大，含有高密度的成红细胞和网织红细胞[38]。此外，VEGF及其受体的过表达常见于血液系统恶性肿瘤[39]，VEGFR-2在红白血病细胞中表达升高，同时脾脏基质细胞分泌的VEGF显著增加，体外实验表明，VEGF增加了小鼠红白血病细胞的增殖率[35]，用针对VEGF的中和抗体治疗的红白血病小鼠生存期更长[40]，在人红白血病细胞（TF1）中的研究证实，外源性VEGF刺激VEGFR-2能够诱导细胞增 殖和存活[30]。近期的临床研究发现VEGF及其受体与淋巴瘤的发展存在相关性，淋巴瘤诊断初期血清VEGF较低，经治疗后，血清VEGF显著升高[41]。上述研究表明，VEGF及其受体在恶性肿瘤性疾病的发生、发展中发挥重要的作用，同时可能对造血系统产生影响。

3结语与展望 通过以上研究可以看出，低氧环境对VEGF及其受体的表达至关重要，而后者参与对造血发育的调控，通过诱导与造血相关转录因子调节胚胎早期造血；通过细胞表面受体VEGFR-1和VEGFR-2参与HSC的动员、造血重建，调控造血细胞的增殖、分化，而VEGF及其受体的异常往往会对造血产生不良结局。同时，VEGF内分泌途径影响造血干细胞存活的研究提示我们，VEGF发挥作用既有内部途径，又有外部途径，体现了VEGF及其信号通路调控细胞增殖分化功能的广泛性与复杂性。从多个角度思考VEGF信号对细胞的影响将是我们研究与之相关肿瘤性疾病发生的重要出发点，并为治疗这些疾病带来新的靶点和更有效的方式。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突