醋五味子配方颗粒及其原料药材饮片中3个木脂素成分的含量测定△

刘子祯，姜蕊，杨浩

1.康美药业股份有限公司，广东 深圳 518000；

2.保定市第一中心医院 中药药剂科，河北 保定 071000；

3.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；

4.湖南普瑞玛药物研究中心有限公司，湖南 长沙 410000

五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实，其味酸、甘，性温，归肺、心、肾经，具有收敛固涩、补肾宁心之效，常被用于治疗内热消渴、心悸失眠等症[1-2]。五味子经过醋蒸法炮制至黑色即得醋五味子[1]。醋五味子经提取、浓缩、干燥即可制成供中医临床配方用的醋五味子配方颗粒[3]。五味子与醋五味子均被《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版收载，同时，《中国药典》2020 年版要求两者均对五味子醇甲进行含量测定[1]。对于醋五味子配方颗粒，虽有少量文献报道其原儿茶酸、绿原酸、五味子甲素及五味子乙素的含量测定研究，但鲜有报道其五味子醇甲的含量研究[3-4]。五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H 均是五味子中主要的木脂素类成分，具有降低肝炎患者血清谷丙转氨酶的作用，同时可显著抑制15-脂加氧酶（15-LOX）、环氧化酶-1（COX-1）和COX-2 活性[5-6]。目前，虽然国家药典委员会发布了《中药配方颗粒品种试点统一标准》160 个品种的标准公示稿，但醋五味子配方颗粒标准依然处于空白状态。

研究报道，醋蒸法炮制和配方颗粒的干燥温度对中药中成分会产生一定影响[7-9]。但有关醋五味子配方颗粒从原料药材到饮片，再到配方颗粒各阶段中成分含量的变化情况，目前鲜有研究报道。

因此，建立醋五味子配方颗粒含量测定方法，阐明其从原料药材到配方颗粒各阶段成分及含量的变化情况，对醋五味子配方颗粒质量控制具有重要意义。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）建立了同时测定醋五味子配方颗粒及原料药材、饮片中五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H 的含量测定方法，同时对配方颗粒生产的各阶段成分变化进行分析，为相关标准的制定提供参考。

1 材料

1.1 仪器

2695 型alliance HPLC 仪，包 括G1311B 型四元泵、G1367E型自动进样器、G1316A型二极管阵列检测器（PDA）、G1330B 型柱温箱、色谱工作站（Waters 公司）。Sartorius arium® Pro DI 型超纯水系统、BP 211D 型十万分之一天平、ME36S 型百万分之一分析天平（德国赛多斯公司）；FW80 型高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品五味子醇甲（批号：110857-201815，纯度：99.7%）购自中国食品药品检定研究院；对照品五味子醇乙（批号：ST05480120，纯度≥98.0%）、当归酰基戈米辛H（批号：ST17510105，纯度≥98.0%）均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；乙腈、甲醇（色谱级，赛默飞世尔科技有限公司）；水为纯化水。

19批五味子药材（编号：Y1～Y19）均经康美药业股份有限公司质量管理中心刘茂贵主任药师鉴定为五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实。所有药材均按《中国药典》2020 年版炮制方法炮制成醋五味子饮片（编号：Z1～Z19），再将醋五味子提取、浓缩、干燥制成19 批醋五味子配方颗粒（编号：S1～S19），样品信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

AgilentZORBAXSB-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5 μm）；以乙腈（A）-水（B）为流动相梯度洗脱（0～25 min，45%～55%A）；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为220 nm；进样量为10µL。理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于2000。

2.2 对照品溶液的制备

取对照品五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H，加甲醇制成五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H质量浓度分别为15.2、7.8、4.6 μg·mL-1的混合对照品溶液，冷藏，备用。另依次分别称取上述3 个对照品55.44、18.96、9.78 mg，分别置于30 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成单一对照品储备液，备用。

2.3 供试品溶液的制备

分别取五味子药材、醋五味子饮片粉末（过三号筛）各约0.25 g（醋五味子配方颗粒研成细粉，精密称取约0.5 g），分别置于锥形瓶中，加甲醇50 mL，称定质量，超声（250 W，20 kHz）30 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，即得五味子药材、醋五味子饮片及醋五味子配方颗粒供试品溶液。另取糊精（配方颗粒中添加的辅料）0.25 g，同法制得阴性对照溶液。

2.4 专属性试验

将混合对照品溶液、药材（Y1）供试品溶液、饮片（Z1）供试品溶液、配方颗粒（S1）供试品溶液、阴性对照溶液分别按2.1 项下色谱条件进行HPLC 分析，结果见图1。对照品、供试品溶液色谱图的基线均平稳且色谱峰分离度、对称性良好，供试品色谱峰在与对照品色谱峰相应位置上有相同保留时间的色谱峰，且阴性对照无干扰，说明色谱方法专属性良好。

图1 混合对照品、醋五味子配方颗粒及其对应的药材与饮片及阴性对照样品的HPLC图

2.5 线性关系考察

取2.2项下制备的混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件，依次分别进样2、4、8、15、20、25µL，以对照品质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得各标准曲线回归方程：五味子醇甲Y=2.83×106X-3.93×106（r=0.999 8），线性范围0.030～0.380 μg；五味子醇乙Y=2.03×106X-3.67×106，（r=0.999 8），线性范围0.016～0.195 μg；当归酰基戈米辛HY=1.87×106X-4.92×105，（r=0.999 8），线性范围0.009～0.115 μg，结果表明所测各成分在相应的进样量范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

取2.2项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进针6 次，每次10 μL，计算得到五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H 峰面积的RSD分别为0.33%、0.66%、0.28%。表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验

分别取Y1、Z1、S1 样品粉末，按2.3 项下方法分别制备6份供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，计算各样品中被测成分的含量。五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H 的平均质量分数分别为0.67%、0.27%、0.09%，RSD 分别为0.46%、0.52%、0.72%（Y1）；0.73%、0.29%、0.11%，RSD 分 别 为0.72%、0.56%、0.63%（Z1）；0.22%、0.08%、0.04%，RSD 分 别 为0.84%、1.01%、1.97%（S1）。表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验

分别取Y1、Z1、S1 样品粉末，按2.3 项下方法分别制备供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、16、20、24 h 进样测定，记录峰面积。五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H 峰面积的RSD 分别为0.94%、0.58%、1.12%（Y1）；1.52%、1.4%、0.77%（Z1）；0.99%、0.31%、0.20%（S1）。说明各供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的五味子药材粉末（Y1）0.25 g、醋五味子饮片粉末（Z1）0.25 g、醋五味子配方颗粒（研细，S1）0.5 g，各9份，精密称定，分别精密加入2.2项下单一对照品溶液适量（加入量为各样品中待测成分已知含量的80%、100%、120%），自然挥干，按2.3项下方法处理，再按2.1项下色谱条件测定，记录峰面积并计算加样回收率（表2～4）。

表2 五味子中3个成分的加样回收率试验结果

2.10 样品含量测定

按2.3 项下方法制备五味子药材（Y1～Y19）供试品溶液、醋五味子饮片（Z1～Z19）供试品溶液、醋五味子配方颗粒（S1～S19）供试品溶液，每个供试品平行3份，再按2.1项下色谱条件测定，计算各供试品中3个被测成分的含量，结果见表5～7。19批五味子药材样品中，五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H 的质量分数分别为0.44%～0.88%、0.11%～0.44%、0.07%～0.14%。19 批醋五味子饮片样品中，五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H 的 质 量 分 数 分 别 为0.48%～0.91%、0.13%～0.47%、0.09%～0.15%。19 批醋五味子配方颗粒样品中，五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H的质量分数分别为0.15%～0.36%、0.02%～0.16%、0.02%～0.06%。整体上，五味子药材、醋五味子饮片、醋五味子配方颗粒中，五味子醇甲含量均最高，五味子醇乙次之，当归酰基戈米辛H最少。

表5 五味子药材中3个成分的质量分数（n=3）

表3 醋五味子饮片中3个成分的加样回收率试验结果

3 讨论

本研究建立了同时测定醋五味子配方颗粒及原料药材、饮片中五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H 含量测定方法，该方法分析时间短、专属性强、准确度高，适用于醋五味子配方颗粒及原料药材、饮片的质量评价。

不同产地对比：来自道地产区黑龙江、吉林和辽宁的五味子药材（Y11～Y15）中各成分含量相对稳定[10]。来自河北省唐山市的五味子药材Y18、Y19中3 个成分含量最高，而Y16、Y17 中含量则最低，说明河北产的五味子药材质量不稳定，可能与采收期、加工方式有关[11]。配方颗粒及其原料药材、饮片之间对比：整体上，与五味子药材相比，醋五味子饮片中3 个木脂素成分的含量均稍有提高，可能是由于这3 个成分化学结构均含有羟基，而炮制辅料醋主要成分乙酸的化学结构中含有羧基，炮制过程中羟基与羧基产生氢键作用，促使3 个成分在乙酸环境下更容易溶出[12]。

表4 醋五味子配方颗粒中3个成分的加样回收率试验结果

前期，醋五味子标准汤剂制备研究结果显示，五味子醇甲、五味子醇乙、当归酰基戈米辛H 从药材转移至标准汤剂的含量转移率仅约25%，说明进入患者体内的成分量较少，大部分（约75%）残留于煎煮后的药渣中，这是五味子醇甲等木脂素类成分难溶于水的物理性质所致。醋五味子配方颗粒，实际上是对标准汤剂进行浓缩、干燥，再进行制粒所得，因此，患者服用对应的配方颗粒后所摄入的成分含量和标准汤剂是一致的。本研究中，每克醋五味子配方颗粒相当于4 g饮片。

表6 醋五味子饮片中3个成分的质量分数（n=3）

表7 醋五味子配方颗粒中3个成分的质量分数（n=3）

本研究还做了以下探究：1）供试品的制备方法考察。对不同溶剂包括水、70%乙醇、稀乙醇、甲醇、50%甲醇进行比较，结果以甲醇超声提取30 min所提出的成分含量最高，故采用甲醇作为提取溶剂。2）流动相系统的对比。与甲醇-水系统相比，乙腈-水系统下的色谱峰保留时间更小、系统压力更小，因此流动相采用乙腈-水。3）检测波长的确定。对供试品溶液进行全波长（200～400 nm）扫描，当波长为220 nm时，各待测成分色谱峰峰高最高，故波长定为220 nm。4）色谱柱的对比。因Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱的分离效果较Thermo Hypersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）略好，故选用Agilent 色谱柱。5）不同流速及柱温对各待测成分色谱峰分离效果的影响考察，结果表明柱温为30 ℃、流速为1.0 mL·min-1时样品的分离效果较好。