骨桥蛋白对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

覃月超 袁小林 曲范杰

1.大连市第三人民医院肿瘤科，辽宁大连 116033；2.大连大学附属中山医院中心实验室，辽宁大连 116011

胃癌是常见的恶性侵袭性肿瘤之一，其在全球恶性肿瘤中发病率和死亡率均较高[1]。尽管目前有根治性手术切除和辅助治疗等手段，但其预后仍然很差，因此，探索胃癌相关基因及其作用机制对于胃癌的靶向治疗和改善胃癌患者的预后具有重要的意义[2-4]。近年来，研究发现骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种细胞外基质蛋白，在各种恶性肿瘤中过表达，并参与多种细胞进程，如增殖、侵袭、转移和血管生成[5-7]。本研究中沉默OPN 在胃癌细胞SGC-7901 中表达，探究OPN 对胃癌SGC-7901 细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响，并探究所涉及的相关蛋白，以期为OPN 作用于胃癌机制的深入研究和胃癌的靶向治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞、干扰载体 胃癌SGC-7901 细胞系：购自上海细胞保藏中心。NC-shRNA 阴性对照载体和OPN-shRNA 载体构建于上海生工生物公司。

1.1.2 试剂与仪器 RPMI-1640（HYclon 公司，货号：AC10210670），胎牛血清（天津灏洋生物制造有限公司，货号：20101020），UltraFectinTM 转染试剂（上海源培生物科技股份有限公司，货号：1692499），Matrigel基质胶（BD 公司，货号：6095004），OPN 一抗、β-actin内参（Abbkine 公司，货号：Abp52084、A01010），cyclin D1 一抗、VEGF 一抗、基质金属蛋白酶2（matrix metallo proteinase 2，MMP-2）一抗（北京博奥森生物科技有限公司，货号：bs-0623R、bs-0729R、bs-4599R），倒置显微镜（Leica Microsystem，型号：DM IL 三目）；伯乐Bio-rad 垂直电泳系统（BIO-RAD Laboratories，型号：1658033）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SGC-7901 细胞在含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素一链霉素的RPMll640 培养基，37℃5%CO2培养箱中培养，细胞生长约90%时，用0.25%胰酶以1∶3 进行传代，细胞培养至第三代可用于后续的实验。

1.2.2 分组处理 control 组：不做处理的SGC-7901 细胞；NC-shRNA 组：转染表达与OPN 基因序列无同源性的载体，排除转染试剂，干扰载体合成方法对细胞的影响；OPN-shRNA 组：转染OPN 载体来沉默细胞中OPN 的表达。

1.2.3 细胞转染 转染前一天，将SGC-7901 细胞接种于6 孔板中，置于37℃5%CO2培养箱中培养至80%融合度，按照试剂说明书进行操作将载体转染到细胞中，转染后6 h 换液，转染后24 h 或48 h 用于后续实验。

1.2.4 MTT 细胞增殖实验 各组细胞浓度均调整为2.5×105/ml，取200 μl 各组细胞悬液分别接种于96孔板中，每组5 个复孔，于培养箱中培养0、24、48、72 h和96 h 后加入MTT 溶液20 μl，继续培养4 h 后吸出溶液，加入DMSO 在摇床中平摇10 min，随后在490 nm 波长下测定孔内吸光值（OD 值）。

1.2.5 Transwell 侵袭迁移实验 用RPMl 1640 以1∶40的比例稀释基质胶，取50 μl 加入到transwell 小室中铺胶，放入培养箱中孵育4～6 h，调整细胞浓度为4×105/ml，取100 μl 细胞悬液加入到上室中，24 孔板下室加入500 μl 含10%胎牛血清的培养基，培养48 h后。4%多聚甲醇固定细胞30 min，1%结晶紫溶液染色20 min，倒置显微镜下观察，随机选取5 个视野计数并拍照。进行迁移实验时，上室无需铺基质胶，培养24 h，其余步骤和侵袭实验相同。

1.2.6 蛋白免疫印迹实验（Western blot）采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA 法进行蛋白浓度测定，采用10%SDS-PAGE 电泳分离蛋白，随后转膜、封闭、一抗（1∶2000）孵育4℃过夜、洗膜、二抗（1∶5000）孵育1 h、洗膜，使用ECL 发光液进行显影。将β-actin 蛋白表达作为内参，使用Image J 软件分析蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 沉默OPN 对SGC-7901 细胞增殖的影响

control 组和NC-shRNA 组细胞增殖速率比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。OPN-shRNA 组细胞增殖速率低于control 组，差异有统计学意义（P ＜0.01）。见图1。

图1 OPN 沉默对SGC-7901 细胞增殖的影响

2.2 沉默OPN 对SGC-7901 细胞侵袭性的影响

control 组和NC-shRNA 组细胞侵袭和迁移能力比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；OPN-shRNA 组细胞侵袭和迁移能力低于control 组，差异有统计学意义（P ＜0.01）。见图2。

图2 沉默OPN 对SGC-7901 细胞侵袭性的影响

2.3 沉默OPN 对SGC-7901 细胞cyclinD1、VEGF 和MMP-2 蛋白表达的影响

control 组 和NC-shRNA 组cyclinD1、VEGF 和MMP-2 蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）；OPN-shRNA 组cyclinD1、VEGF 和MMP-2 蛋白表达水平低于control 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3。

图3 沉默OPN 对SGC-7901 细胞cyclinD1、VEGF和MMP-2 蛋白表达的影响

3 讨论

OPN 在多种癌症中具有促进癌细胞的黏附、增殖、侵袭、转移和血管生成等作用[5,8-15]。但是OPN 在胃癌细胞中的生物学作用仍不明确，需要做进一步的探索。本研究采用多种实验方法研究OPN 在胃癌SGC-7901 细胞中的作用，发现降低胃癌细胞中OPN 的表达后，SGC-7901 细胞的增殖、侵袭和迁移能力减弱，其cyclinD1、VEGF 和MMP-2 蛋白表达水平也有所下降。

OPN 的过表达与癌症患者的一些临床病理特征有关，如高增值指数、淋巴结和血管浸润及远处转移，因此OPN 的过度表达可作为癌症患者预后不良和肿瘤复发的一项独立的预后指标[16]。研究报道，敲低OPN 在卵巢癌SKOV-3 和OVCAR-3 细胞中的表达，能够显著降低卵巢癌细胞的增殖[17]。将siRNAOPN SGC-7901 细胞注射到小鼠体内，发现OPN 下调抑制小鼠体内肿瘤的生长和转移，提高小鼠的存活率[18]。本研究使用OPN 特异性shRNA 下调OPN 的表达，在有效地沉默了OPN 基因后，本研究观察到SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移能力降低。结合之前的研究报道，可以推测出OPN 在胃癌细胞中处于过表达状态，并促进癌细胞的发生发展过程。为了探讨OPN 是如何调节胃癌细胞系的增殖、侵袭和迁移能力的，本研究采用Western blot 实验检测OPN shRNA 干扰前后SGC-7901 细胞相关蛋白水平变化情况，结果发现沉默OPN 基因表达后，SGC-7901 细胞的cyclin D1、MMP-2 和VEGF 蛋白表达水平均下降。细胞周期失调是细胞恶性增殖的机制之一，cyclin D1 蛋白对细胞周期的调控起着重要作用，cyclin D1 蛋白过表达导致乳腺癌细胞异常增殖以及促进乳腺癌的发生[19]。OPN激活后的信号传导可以促进MMP-2 等基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase 2，MMPs）的蛋白水解酶的表达，MMPs 与黏附分子结合并降解细胞外基质成分，从而促进癌细胞的运动，且MMP-2 可降解Ⅳ胶原和Ⅴ胶原，进一步增强肿瘤细胞消化血管基底和组织屏障的能力，最终促进肿瘤细胞侵袭和迁移[20-21]。在体内实验发现，VEGF 和OPN 在肿瘤血管生成中起着协同作用，增强肿瘤细胞进入循环的能力，最终促进肿瘤向其他器官的侵袭和转移[22]。此外，研究发现OPN通过调节uPA，MMP-2 和MMP-9 蛋白来提高癌细胞的侵袭转移能力[23-24]。VEGF 通过自分泌机制上调癌细胞的MMP-9 表达,从而促进肝癌和黑色素瘤的浸润转移[25-26]。本研究结果提示OPN 通过激活某些信号传导通路调节cyclin D1、MMP-2 和VEGF 的表达，从而促进胃癌细胞系的增殖、侵袭和迁移。

本研究只是在细胞水平上研究OPN 对胃癌的作用，具有一定的局限性，体内实验研究和临床应用研究是未来我们努力的一个方向。

综上所述，本研究提示OPN 能增强胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，其作用机制与cyclin D1、VEGF和MMP-2 蛋白的表达相关，但其具体调控机制还需做进一步的研究。