Nrf2激活剂RTA-403抗阿尔茨海默病活性研究

马沛沛 黄 青 魏世杰 王志忠▲

1.宁夏医科大学药学院，宁夏银川 750004；2.宁夏医科大学回医药现代化省部共建教育部重点实验室，宁夏银川 750004；3.宁夏医科大学总医院药剂科，宁夏银川 750004

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是进行性认知障碍和记忆能力损伤为特征的疾病[1]。世界卫生组织估计，到2050年AD患者可能接近1.14亿例[2]。目前不能完全治愈AD，寻找有效可行的AD治疗手段十分迫切[3]。

AD可能与氧化应激（oxidative stress，OS）有关，是组织氧化还原平衡发生了改变[4]。OS被认为是多种神经系统退行性疾病的发病机制之一[5]，当活性氧自由基产生超过细胞抗氧化能力时会发生OS[6]。核转录因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid2 related factor 2，Nrf2）在OS条件下会发挥抗氧化保护作用[7]。Nrf2随着年龄的增长而降低[8]，导致OS反应失衡[9]。β淀粉样蛋白（beta amyloid protein，Aβ）的异常沉积是AD主要发病机制之一[10]。在AD转基因小鼠模型中，有Aβ斑块的出现[11]。Nrf2能保护神经干细胞免受Aβ的毒性反应[12]。因此，本实验将在小鼠模型上考察Nrf2激活剂RTA-403抗AD的药效。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和分组在正式实验前，小鼠 适 应 性 饲 养 一 周，温 度（22±2）℃，湿 度45%～65%，明暗周期12 h。采用2周龄的野生型（wild type，WT）小鼠、Nrf2基因敲除小鼠、颅内注射Aβ小鼠，体重20 g左右，雌雄各半，随机分为六组：WT组、Nrf2基因敲除组、Aβ组、WT+RTA-403组、Nrf2基 因 敲 除+RTA-403组、Aβ+RTA-403组，每组各15只，其中前三组小鼠均给予普通饲料喂养，后三组小鼠均给予含有RTA-403[50 mg/（kg·d）]体积分数的饲料喂养。

1.1.2 试剂与仪器Nrf2基因敲除小鼠从美国Jackson实验室引进。RTA-403 （MedChemExpress 公司）；重组Anti-beta Amyloid（Aβ）抗体[mOC64]（abcam 公司）；实验用水为蒸馏水。WT、Aβ组均为C57BL /6J 小鼠，购自宁夏医科大学动物实验中心，质量合格证号： SCXK（宁）2020-0063。LW-Morris水迷宫实验设备（上海洛维生物科技有限公司） ；Y迷宫实验设备（安徽正华生物仪器设备有限公司）；小鼠代谢笼、小鼠体重秤、动物血糖测试仪（上海玉研科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠Aβ模型（AD模型）的建立参照有关文献[13]，小鼠乙醚麻醉后，用10 μl微量进样器侧脑室一次性注入3 μl凝聚态Aβ抗体（含Aβ抗体3 μg，37℃ 96 h使其成凝聚态），留针1 min[14]。

1.2.2 水迷宫实验水迷宫实验在LW-Morris设备中进行，其为圆形宫体，在target象限中心水面下1 cm处放置一平台，池内水温（22±2）℃[15]。实验在第8周开展，持续6 d，前5 d为训练阶段，每天上午和下午均进行一次，设置程序为“定位航行测试”，将小鼠从每个象限的中点放入水中，开始记录，待小鼠找到隐藏平台时，停止记录，所用时间即为潜伏期。无论小鼠是否找到平台，每次结束后，都将其放置在平台上训练30 s[16]。第6天为测试实验，记录6组小鼠的潜伏期。

1.2.3 Y迷宫实验Y迷宫由黑色亚克力板组成等长的3个臂（30 cm×6 cm×15 cm）[17]，每臂底部及交界处均铺设电热板，顶部装有12 W的信号灯[18]。实验开始时随机选择1个臂亮灯、不通热为安全区，其余2个臂不亮灯及交界处均通热（60℃～80℃）为非安全区[19]。在实验的第4、6、8周，将小鼠分别依次放入Y迷宫中适应20 s后，打开安全区信号灯，然后将小鼠放到起始臂中，小鼠受到热刺激后成功逃到安全区且停留5 s，将此视为1次训练。每只小鼠重复训练直到达标为止（连续20次训练中≥18次正确即为达标）[20]。最后比较第6、8周，6组小鼠30次实验内训练及错误的次数。

1.2.4 生理生化指标实验第9周，称量记录每只小鼠的体重。使用代谢笼，配上粪尿分离漏斗收集每只小鼠的尿量。用毛细管刺小鼠内眦处取血，分离血清30～40 μl，使用便携式血糖仪检测每只小鼠的血糖。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据统计。实验数据均以均数±标准差（）表示，使用方差分析，方差齐时用配对样本t检验，方差不齐时用t’检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 六组小鼠的水迷宫实验比较

Nrf2基因敲除组潜伏期长于WT组（P＜ 0.01），Aβ组潜伏期长于WT组（P＜ 0.01）。而WT+RTA-403组相对于WT组潜伏期无明显变化（P＞ 0.05）。Nrf2基因敲除+RTA-403组相对于Nrf2基因敲除组潜伏期没有明显缩短（P＞ 0.05）。Aβ+RTA-403组相对于Aβ组潜伏期显著缩短（P＜ 0.01）。见图1。

图1 六组小鼠水迷宫潜伏期（n=15）

2.2 六组小鼠Y迷宫实验比较

第6周和第8周的错误次数：Nrf2基因敲除组与WT组相比，明显增多（P＜ 0.01），Aβ组与WT组相比，明显变多（P＜ 0.01）。WT+RTA-403组与WT组相比，无明显变化（P＞ 0.05）。Nrf2基因敲除+RTA-403组与Nrf2基因敲除组相比，无明显变化（P＞ 0.05）。Aβ+RTA-403组与Aβ组相比，明显减少（P＜ 0.05），见表1。

表1 六组小鼠Y迷宫训练次数和错误次数比较（次，±s）

表1 六组小鼠Y迷宫训练次数和错误次数比较（次，±s）

注 第六周：■与◆比较，t=5.266，P=0.0001 ＜ 0.01；▲与◆比较，t=3.878，P=0.002 ＜ 0.01；×与◆比较，t=0.311，P=0.761 ＞ 0.05；+与■比较，t=-0.371，P=0.716 ＞ 0.05；●与▲比较，t=-2.495，P=0.026 ＜ 0.05。第八周：■与◆比较，t=8.829，P=0.0001 ＜ 0.01；▲与◆比较，t=6.929，P=0.0001 ＜ 0.01；×与◆比较，t=-0.281，P=0.783 ＞ 0.05；+与■比较，t=-0.572，P=0.567 ＞ 0.05；●与▲比较，t=-5.667，P=0.0001 ＜ 0.01

组别 n 训练次数 错误次数第6周 第8周 第6周 第8周WT组 15 20.20±1.30 20.30±1.00 12.24±1.90◆ 10.40±2.10◆Nrf2基因敲除组 15 19.70±1.40 19.80±1.50 14.65±1.70■ 16.71±2.30■Aβ组 15 19.90±1.50 20.00±1.20 14.48±1.30▲ 16.33±1.90▲WT+RTA-403组 15 20.20±1.20 20.30±0.80 12.21±1.90× 10.37±3.10×Nrf2基因敲除+RTA-403组 15 19.75±1.60 19.85±1.30 14.46±1.20+ 16.54±2.40+Aβ+RTA-403组 15 20.10±1.20 20.20±1.10 13.13±1.40● 12.11±1.80●

2.3 六组小鼠生理生化指标比较

小鼠的体重、尿量和血糖：Nrf2基因敲除组与WT组相比，显著降低（P＜ 0.01），Aβ组与WT组相比，明显降低（P＜ 0.05）。WT+ RTA-403组与WT组相比，几乎无变化（P＞ 0.05）。Nrf2基因敲除+RTA-403组与Nrf2基因敲除组相比，无显著变化（P＞ 0.05）。Aβ+RTA-403组与Aβ组相比较，明显升高（P＜ 0.05），见表2。

表2 六组小鼠生理生化指标比较（±s）

表2 六组小鼠生理生化指标比较（±s）

注 体重：■与◆比较，t=8.839，P=0.0001 ＜ 0.01；▲与◆比较，t=-8.361，P=0.0001 ＜ 0.01；×与◆比较，t=1.313，P=0.210 ＞ 0.05；+与■比较，t=0.670，P=0.514 ＞ 0.05；●与▲比较，t=5.714，P=0.0001 ＜ 0.01.尿量：■与◆比较，t=7.788，P=0.0001 ＜ 0.01；▲与◆比较，t=4.005，P=0.001 ＜ 0.05；×与◆比较，t=0.630，P=0.539 ＞ 0.05；+与■比较，t=0.427，P=0.676 ＞ 0.05；●与▲比较，t=4.904，P=0.0001 ＜ 0.01。血糖：■与◆比较，t=3.323，P=0.005 ＜ 0.01；▲与◆比较，t=1.410，P=0.001 ＜ 0.05；×与◆比较，t=0.937，P=0.365 ＞ 0.05；+与■比较，t=1.338，P=0.202 ＞ 0.05；●与▲比较，t=2.265，P=0.040 ＜ 0.05

组别 n 体重（g） 尿量（ml/d） 血糖（mmol/L）WT组 15 33.08±2.41◆ 10.15±2.01◆ 7.83±2.59◆Nrf2基因敲除组 15 24.05±2.59■ 5.31±2.22■ 6.05±2.67■Aβ组 15 25.12±2.37▲ 5.78±4.02▲ 5.32±1.65▲WT+RTA-403组 15 32.89±2.61× 10.08±4.31× 7.01±2.39×Nrf2基因敲除+RTA-403组 15 25.22±2.73+ 5.97±4.08+ 6.38±2.41+Aβ+ RTA-403组 15 31.43±2.36● 8.32±3.05● 6.98±2.31●

3 讨论

水迷宫实验Nrf2基因敲除组潜伏期长于WT组，Aβ组潜伏期长于WT组；Y迷宫实验第6周和第8周的错误次数，Nrf2基因敲除组与WT组相比，明显增多，Aβ组与WT组相比，明显变多；小鼠的体重、尿量和血糖，Nrf2基因敲除组与WT相比，显著降低，Aβ组与WT模型组相比，明显降低，均提示Nrf2基因敲除组和Aβ组的小鼠学习认知功能受到了损伤，Nrf2基因缺失与AD有关联。

水迷宫实验WT+RTA-403组相对于WT组潜伏期无明显变化；Y迷宫实验第6周和第8周的错误次数，WT+RTA-403组与WT组相比，无明显变化；小鼠的体重、尿量和血糖，WT+RTA-403组与WT组相比较，几乎无变化，均提示可能是由于WT组小鼠本身认知功能没有受损，给予RTA-403不会对小鼠的学习记忆行为产生明显影响。

水迷宫实验Nrf2基因敲除+RTA-403组相对于Nrf2基因敲除组潜伏期无明显缩短；Y迷宫实验第6周和第8周的错误次数，Nrf2基因敲除+RTA-403组与Nrf2基因敲除组相比，无明显变化；小鼠的体重、尿量和血糖，Nrf2基因敲除+RTA-403组与Nrf2基因敲除组相比，无显著变化，均提示可能是小鼠的Nrf2基因敲除后，Nrf2激活剂RTA-403无从发挥神经保护及抗AD的作用。

水迷宫实验Aβ+RTA-403组相对于Aβ组潜伏期显著缩短；Y迷宫实验第6周和第8周的错误次数，Aβ+RTA-403组与Aβ组相比，明显减少；小鼠的体重、尿量和血糖，Aβ+RTA-403组与Aβ组相比，明显升高，均提示RTA-403有一定的抗AD的药效。

综上所述，可以推测Nrf2激活剂RTA-403能显著改善Aβ组小鼠的行为学习能力，对于WT组和Nrf2基因敲除组小鼠无明显影响，提示Nrf2通路可作为AD治疗的研究方向，Nrf2激活剂RTA-403能够使AD小鼠的认知功能得到改善。