HDAC3和HDAC8在滩羊生长卵泡中的定位与表达模式分析

柳雨均, 范闪闪, 徐娅秀, 杨 易, 王 超, 刘新峰，夏国良,

(1.宁夏大学/西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，银川 750021；2.宁夏大学生命科学学院，银川 750021；3.中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室，北京 100193)

【研究意义】滩羊是我国具有较高经济价值但繁殖率较低的绵羊品种[1]。现阶段，利用胚胎工程技术结合饲养管理的优化等可较显著地提高家畜的繁殖效率，但目前现代繁殖技术在滩羊的繁殖扩群方面的应用普及率不高，相关原因与对滩羊的生殖生理机制研究不充分有关。由于成熟卵母细胞的质量直接影响早期胚胎的发育潜能，因此掌握卵母细胞的成熟调控机制，是利用胚胎工程技术快速扩繁滩羊的重要前提[2]。故加强对促性腺素诱导滩羊卵母细胞成熟调控机制的基础研究至关重要。【前人研究进展】在哺乳动物卵泡生长发育期间，存在着大量基因表达失活与激活同步进行的情况，而这些基因表达相关的调节又受到多种表观遗传修饰因素调控[3-6]。例如，常见的表观修饰包括DNA甲基化[7]、组蛋白修饰[8](乙酰化、磷酸化、甲基化及泛素化)及miRNA调控[9]等。其中，组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases，HADCs)是一类真核生物细胞中的蛋白酶，可通过对组蛋白的去乙酰化修饰参与细胞分化、DNA修复和染色体装配等。目前已知的HDACs可以分为4个亚家族：I(HDACs 1、HDACs 2、HDACs 3、HDACs 8)，II(HDACs 4、HDACs 5、HDACs 6、HDACs 7、HDACs 9、HDACs 10)、III(Sirt 1～Sirt 7)和IV(HDAC 11)亚家族[10-12]。其中，I类HDACs存在于多种哺乳动物体内，是一种广泛表达的核酶[13]，并在细胞存活、增殖、分化和癌症发展中起着关键作用[14-15]。在小鼠中，条件性敲除HDAC1和HDAC2会导致雌性不育[16]。在卵母细胞成熟过程中，HDAC2可以通过调节组蛋白H4上第16位赖氨酸残基(H4K16)的乙酰化水平而影响染色体分离和动粒功能。近期研究还发现，HDAC3在小鼠响应促性腺素信号，参与卵泡发育和卵母细胞成熟的关键性开关分子，卵母细胞成熟进程方面发挥着重要调节作用[17]。有研究报道，HDAC8对小鼠和猪的卵母细胞成熟也发挥着重要调节作用[18-19]。【本研究切入点】有关HDAC家族成员在滩羊卵泡发育及卵母细胞成熟方面的可能作用及机制的报道尚不多见。【拟解决的关键问题】本研究拟结合免疫组化、免疫荧光和蛋白免疫印迹等方法，分析HDAC3和HDAC8在滩羊生长级别卵泡中的定位及表达模式，以期为深入研究二者对滩羊卵泡及卵母细胞发育的机制提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于宁夏回族自治区银川市永宁县屠宰场采集成年健康滩羊卵巢。

1.2 主要试剂

免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒(中杉金桥)；TRIzol 试剂(Ambion)；一抗兔抗HDAC3抗体、兔抗HDAC8抗体(Abcam)；兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(Proteintech)；二抗Alexa Fluor 488标记的驴抗兔IgG(H+L)(上海翊圣生物科技有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(凯基生物)；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix， HIScript III RT SuperMIX for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme)。

1.3 卵巢处理及各级卵泡分离

将新鲜采集的卵巢置于37 ℃的无菌生理盐水中，在2 h内带回实验室。随后，用含有1% 抗生素的生理盐水冲洗分拣后随机分为2份：一份置于4%多聚甲醛溶液中固定，经石蜡包埋后用于免疫组织化学和免疫荧光分析；另一份用于机械剥离各级卵泡。本实验参考山羊卵泡分级方法[20]，将所分离卵泡分为：小有腔卵泡(直径0.5～3.0 mm)、大有腔卵泡(直径3.0～5.0 mm)及排卵前卵泡(直径>5.0 mm)[15]，随后将各级卵泡分别置于液氮中保存，用于蛋白免疫印迹测定。

1.4 免疫组织化学分析

将石蜡包埋的卵巢组织切成6 μm的切片，根据免疫组化试剂盒(中杉金桥)说明书进行操作。石蜡切片依次经脱蜡和脱水，抗原修复，滴加内源性过氧化物酶阻断剂。随后，经磷酸盐缓冲液(PBS，pH为7.2～7.4)洗涤3次，每次3 min。滴加山羊血清封闭液，室温封闭45 min。之后，分别滴加一抗兔抗HDAC3 抗体(1∶100稀释)、一抗兔抗HDAC8 抗体(1∶50稀释)或兔抗IgG(1∶100稀释)，于4 ℃孵育过夜后用PBS清洗3次，每次3 min。滴加反应增强液，室温孵育20 min后，PBS清洗3次，每次3 min。滴加辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG聚合物，室温孵育20 min后PBS清洗3次，每次3 min。DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。

1.5 免疫荧光分析

将石蜡包埋的卵巢组织切成6 μm切片，经脱蜡和脱水，抗原修复后，PBS清洗3次，每次5 min。滴加10%驴血清封闭45 min。分别滴加一抗兔抗HDAC3 抗体(1∶100稀释)、一抗兔抗HDAC8抗体(1∶50稀释)、兔抗IgG(1∶100稀释)，4 ℃孵育过夜后PBS清洗3次，每次10 min。滴加荧光二抗(1∶100稀释)和Hoechst(1∶1000稀释)37 ℃ 孵育1 h。PBS清洗3次，每次10 min。加入抗荧光淬灭剂后封片，显微镜避光观察。

1.6 蛋白免疫印迹检测

利用蛋白提取试剂盒分别提取滩羊各级卵泡总蛋白，使用微量分光光度仪检测样品的总蛋白含量。配制10%分离胶和4%浓缩胶，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳完毕后，使用甲醇浸泡过的PVDF膜于300 mA 转膜90 min。取出后于5% 脱脂牛奶中室温封闭60 min。分别滴加一抗兔抗HDAC3抗体(1∶5000稀释)、一抗兔抗HDAC8 抗体(1∶250 00稀释)或一抗兔抗GAPDH抗体(1∶5000稀释)，4 ℃ 孵育过夜。TBST清洗6次，每次5 min。滴加二抗(1∶5000稀释)室温孵育60 min。TBST清洗6次，每次5 min。滴加ECL化学发光液后曝光。

2 结果与分析

2.1 HDAC3和HDAC8在滩羊卵泡中定位与表达

利用免疫组化技术观察HDAC3和HDAC8在滩羊卵泡发育中的表达定位。在滩羊卵泡中，HDAC3和HDAC8均有表达，其中HDAC3定位于原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡的颗粒细胞，有腔卵泡的颗粒细胞和卵丘细胞细胞质(图1-A)。HDAC8主要定位于原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞，有腔卵泡的卵母细胞、颗粒细胞和卵丘细胞细胞质(图1-B)。

A.HDAC3在滩羊卵泡中的定位分析；B.HDAC8在滩羊卵泡中的定位分析； CCs为卵丘细胞；MGCs为壁层颗粒细胞；标尺：20 μm；IgG为阴性对照A. Localization of HDAC3 in follicles of Tan sheep; B. Localization of HDAC8 in follicles of Tan sheep; CCs was cumulus cells; MGCs was mural granulosa cells; Scale bar: 20 μm; IgG was negative control图1 HDAC3和HDAC8在滩羊卵泡发育过程中的定位和表达Fig.1 The localization and expression of HDAC3 and HDAC8 in growing follicles of Tan sheep

免疫荧光检测发现(图2-A)，HDAC3定位于原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡的颗粒细胞，有腔卵泡的颗粒细胞和卵丘细胞细胞质中，表达水平随卵泡发育逐步上调。HDAC8主要定位于原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞，有腔卵泡的卵母细胞、颗粒细胞和卵丘细胞细胞质。需要指出的是，与HDAC3不同，HDAC8在原始卵泡的颗粒细胞中表达量最高，伴随着卵泡发育，HDAC8在颗粒细胞中的表达水平逐步下降(图2-B)。

A.滩羊卵泡中表达的HDAC3的免疫荧光分析；B.滩羊卵泡中表达的HDAC8的免疫荧光分析；蓝色荧光为Hoechst特异性标记细胞核，绿色荧光为HDAC3/HDAC8；IgG为阴性对照；标尺：20 μmA. Results of immunofluorescence analysis of HDAC3 expression in follicles of Tan sheep; B. Results of immunofluorescence analysis of HDAC8 expression in follicles of Tan sheep; Nuclei were dyed with Hoechst (blue), green fluorescence was HDAC3/HDAC8; IgG was negative control; Scale bar: 20 μm图2 免疫荧光检测HDAC3和HDAC8在滩羊卵泡发育过程中的定位和表达Fig.2 The localization and expression of HDAC3 and HDAC8 in growing follicles of Tan sheep detected by immunofluorescence

2.2 不同级别卵泡中HDAC3和HDAC8的表达水平

利用蛋白免疫印迹技术对小有腔卵泡、大有腔卵泡及排卵前卵泡中HDAC3和HDAC8的表达进行检测，结果如图3所示。HDAC3蛋白在小有腔卵泡中即有较强的表达，其表达水平随卵泡发育逐步上调，如HDAC3在大有腔卵泡中的表达迅速升高，在成熟卵泡中达到最高且表达量约为小有腔卵泡的2倍。HDAC3在滩羊卵泡发育中的表达变化说明其可能对卵泡的发育，特别是卵泡中颗粒细胞和卵母细胞的发育有一定调控作用。与此同时，笔者发现HDAC8蛋白在小有腔卵泡中即开始有非常强的表达，其表达水平伴随卵泡发育逐步下调，如HDAC8在排卵前卵泡中的表达迅速下调并达到最低，表达量约为小有腔卵泡的1/7。以上结果表明，HDAC8可能也参与卵泡发育及卵母细胞成熟调控，但其作用很可能与HDAC3截然不同。

A.卵巢中分离的各级卵泡；B.蛋白免疫印迹检测各级卵泡中HDAC3和HDAC8蛋白的表达模式，GAPDH为内参校正; C. HDAC3在各级卵泡中的蛋白表达水平的灰度扫描结果分析；D.HDAC8在各级卵泡中的蛋白表达水平的灰度扫描结果分析; *代表P<0.05(差异显著)；**代表P<0.01(差异极显著)A. Follicles isolated from the ovary; B. Expression patterns of HDAC3 and HDAC8 proteins in different follicles were quantified by western blotting analysis, GAPDH was the internal reference correction; C. Analysis of protein expression level of HDAC3 in different follicles by gray-scale scanning; D. Analysis of protein expression level of HDAC8 in different follicles by gray-scale scanning; *stands for P<0.05(significant differences); **stands for P<0.01 (significant extremely differences)图3 HDAC3和HDAC8在滩羊卵泡发育过程中的表达模式Fig.3 Expression pattern of HDAC3 and HDAC8 in the process of follicular development of Tan sheep

3 讨 论

前期研究发现，表观遗传修饰不仅影响哺乳动物的卵泡发育和卵母细胞成熟，而且对胚胎早期的发育调节发挥着关键作用[4]，但是其在滩羊卵泡及卵母细胞发育中的作用尚未见报道。为阐明HDACs家族成员在滩羊卵泡发育中的作用及机制，本研究初步分析了HDAC3和HDAC8的表达模式。通过分析其定位与表达，笔者证实了这2种分子在不同发育阶段卵泡中的表达模式具有显著差异。其中HDAC3在颗粒细胞和卵丘细胞中均表达，且表达量逐步上调，而HDAC8同样在颗粒细胞和卵丘细胞中表达，但表达量随着卵泡发育逐步下调。表明，HDAC3和HDAC8可能在滩羊卵泡发育过程中发挥着重要作用。

HDAC3是维持染色质结构和基因组稳定性、确保正常细胞存活的调节因子[21]。研究显示[22]，HDAC3由于同时含有核定位和核输出序列，可以在小鼠细胞核、细胞质以及细胞膜中表达[23]，并通过与抑制因子 SMRT 和 N-CoR 形成蛋白复合物，调节多基因转录。在小鼠卵巢中，HDAC3主要在生发泡(Germinal vesicle，GV)期卵母细胞细胞核中表达；生发泡破裂(Germinal vesicle breakdown，GVBD)后，HDAC3主要在纺锤体表达，通过去乙酰化微管蛋白促进动粒—微管相互作用的建立，从而确保卵母细胞成熟期间纺锤体/染色体的正常排列[24]。笔者发现，一旦小鼠卵泡颗粒细胞内的HDAC3受促黄体激素(Luteinizing hormone，LH)峰的影响而下调时，即会解除颗粒细胞对EGF样生长因子双调蛋白(Amphiregulin，AREG)的表达抑制作用，从而促进其分泌，最终导致卵丘扩展和卵母细胞成熟[17]。该结果说明，颗粒细胞中的HDAC3对卵泡发育及卵母细胞成熟发挥关键性作用。猪卵母细胞进入减数分裂时，HDAC3开始定位于纺锤体，而抑制HDAC3后会破坏微管的稳定性，从而导致纺锤体缺陷和染色体配对失败[25]。本研究免疫组化及免疫荧光染色结果表明，HDAC3主要在滩羊原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡的颗粒细胞中表达，表达量较低。伴随卵泡发育至有腔卵泡阶段，HDAC3在颗粒细胞和卵丘细胞细胞质中均表达上调。蛋白免疫印迹检测结果进一步证实其在小有腔卵泡、大有腔卵泡及成熟卵泡中表达量逐步上调。说明HDAC3可能参与调控滩羊卵泡及卵泡中颗粒细胞和卵母细胞的发育，但其作用及机制是否与小鼠中的有所不同值得深入挖掘。

研究发现，HDAC8在有丝分裂、转录、染色质重塑和RNA剪接方面发挥着重要作用，同时也是多种疾病的治疗靶点[26]。在小鼠卵母细胞成熟过程中，HDAC8定位于纺锤体两极，在纺锤体组装和染色体配对时发挥着维持整倍体的关键作用[18]。HDAC8广泛分布于GV期小鼠卵母细胞的细胞质中，GVBD后不久，HDAC8开始在染色体周围聚集，由γ-微管蛋白介导，参与纺锤体的正确组装和染色体排列[18]。在猪卵母细胞GV期，HDAC8定位于细胞核，从GVBD到MII期转移至纺锤体两极。通过RNAi特异性沉默HDAC8后，γ-微管蛋白向纺锤极募集失败，破坏纺锤体/染色体结构，导致猪卵母细胞成熟过程中的第一极体排出率下降，减数分裂进程停滞[19]。而在有丝分裂期间，HDAC8广泛表达并定位于细胞核或细胞质[27-28]。HDAC8对牦牛卵母细胞的成熟也具有调控作用[29]。但HDAC8在哺乳动物卵泡颗粒细胞及卵丘细胞中的作用尚未见报道。本研究发现，HDAC8主要在滩羊卵巢原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞，有腔卵泡的卵母细胞、颗粒细胞和卵丘细胞细胞质中表达。伴随着卵泡发育，颗粒细胞中HDAC8表达水平逐步下调。蛋白免疫印迹检测结果进一步证实HDAC8在小有腔卵泡、大有腔卵泡及成熟卵泡中表达量逐步下调。故推测，在滩羊各级卵泡中HDAC8表达水平的变化可能与滩羊卵泡发育及卵泡中颗粒细胞和卵母细胞的发育有关，其与HDAC3间存在何种关系也是值得深入研究。

4 结 论

伴随滩羊卵巢中的卵泡由原始卵泡起始发育后，其生长卵泡发育至有腔卵泡阶段前后，卵泡体细胞中HDAC3和HDAC8均表达，但表达趋势相反，由此提示二者均参与卵泡发育过程，但可能发挥着不同的生理功能。本研究结果为进一步深入研究HDAC3和HDAC8如何参与调节滩羊卵泡及卵母细胞发育机制提供了基本数据和参考。