长期施肥对土nirS型反硝化细菌的影响及其与N2O排放的关系

刘耕苑, 肖 杰, 高明霞, 孙本华,4, 张树兰, 杨学云, 冯 浩,3,4, 张彤勋

(1.西北农林科技大学 资源环境学院/农业部西北植物营养与农业环境重点实验室,陕西 杨凌 712100; 2.西北农林科技大学 水利与建筑工程学院, 陕西 杨凌 712100;3.西北农林科技大学 水土保持研究所, 陕西 杨凌 712100; 4.中国旱区节水农业研究院, 陕西 杨凌 712100)

不同生态系统中，N2O排放与土壤性质和nirS反硝化细菌之间的关系已有不少报道[8-9]。土壤性质会影响N2O排放[10]，N2O排放量与土壤有机碳和土壤硝态氮含量正相关，与土壤pH负相关[5,11-12]。有研究表明，N2O排放量与nirS反硝化细菌丰度和群落结构无关[7]；但也有研究发现，N2O排放量与nirS基因丰度密切相关[13]。这些不同可能主要是由于土壤类型和性质以及施肥方式不同造成的，研究和明确不同土壤类型和土壤性质下nirS反硝化细菌丰度、多样性和群落结构特征及其与N2O排放之间的关系，对于全面理解土壤反硝化过程具有重要意义。

全球60%的N2O排放量来自于农业土壤[14]，其中施肥是影响土壤N2O排放的关键因素。许多研究表明，长期不同施肥方式可引起土壤性质的改变并导致nirS细菌丰度、多样性和群落结构产生显著差异[15-16]。土是人为长期土粪堆垫而形成的典型土壤，是关中地区主要土壤类型[17]，长期施肥对土壤理化性质产生了巨大影响[18]，并且对农田N2O的排放产生影响[19]，但其N2O排放产生差异的原因和微生物机制尚不明确。本研究以20世纪90年代初建立的旱作雨养农田长期施肥定位试验为基础[19]，通过分析长期不同施肥对旱作雨养农田土壤理化性质、N2O排放和nirS型反硝化细菌丰度和群落结构的影响及其相互关系，以期为旱作雨养农田制定合理的肥料管理措施来减缓农田N2O排放提供理论和实践依据[20]。

1 材料与方法

1.1 试验地点和基本情况

长期肥料定位试验位于中国陕西杨凌农业高新技术产业示范区(北纬34°17′、东经108°00′)的“国家黄土肥力和肥料效益监测基地”内。气候类型为暖温带大陆性季风气候，年平均气温为12.9 ℃，年平均降水量为550～600 mm，主要集中在7—9月，蒸发量为993 mm，无霜期184～216 d，没有明显的年变化。土壤类型为土(土垫旱耕人为土)，黄土母质[21]。

1.2 试验设计

长期试验始于1990年秋，种植体系为冬小麦—夏休闲。长期肥料试验共7个处理，本研究选取其中不施肥(CK)、单施氮肥(N)、施氮钾肥(NK)和施氮磷钾肥(NPK)共4个处理，小区面积为399 m2(19 m×21 m)[21]。氮肥用量为135 kg/hm2，磷肥用量为108 kg/hm2，钾肥用量为67.5 kg/hm2。氮、磷和钾肥分别采用尿素、过磷酸钙和硫酸钾。所有肥料均在小麦播前一次性全部施入。

1.3 气体样品采集和测定

气体样品采用静态箱法采集，每个处理随机设置3个静态箱底座，于2017年6月至2018年6月，每隔7 d采集气体样品一次，采用气相色谱法测定N2O浓度，并计算获得年度N2O排放量[19]。

1.4 土壤样品采集

2018年6月小麦收获后采集0—20 cm耕层混合土样，每静态箱附近随机采集9个点组成一个混合样品，样品装入塑封袋并置于冰盒中运回实验室。新鲜样品剔除动植物残体，过2 mm筛后分成三部分[21]。一部分样品风干并保存于室温下用于土壤理化性质分析；一部分保存在<5℃冰箱冷藏并于一周内测定土壤硝态氮；一部分土壤样品保存在-80℃超低温冰箱里用于土壤nirS基因丰度、nirS型反硝化细菌的多样性和群落结构的测定。

1.5 土壤理化性质测定

土壤基本理化性质的测定方法参照土壤农化分析[22]。土壤pH测定采用电极法(水∶土=1∶1)；土壤有机碳采用重铬酸钾容量法；全氮采用硫酸消煮-凯氏定氮法；土壤硝态氮采用KCl浸提-流动注射分析仪测定；土壤有效磷采用NaHCO3浸提-分光光度法；土壤速效钾采用NH4OAC浸提-原子吸收光谱法。

1.6 土壤DNA的提取、qPCR和高通量测序

称取相当于0.5 g干土的鲜土，使用E.Z.N.A.©soil分离试剂盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)进行土壤DNA的提取，使用百分之一的琼脂糖凝胶电泳检测[23]。使用nirS-cd3aF(5′-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3′)和nirS-R3cd(5′-GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3′)引物通过ABI GeneAmp©9700型PCR仪进行扩增[24-25]。nirS基因丰度利用QuantiFluorTM-ST(Promega，USA)进行检测定量[26]。利用Illumina公司的MiseqPE300平台进行测序[23]。共获得了118,932条有效序列，在97%相似度下聚类得到864个OTU。所有处理覆盖率均为99%，说明样品被检出的概率很高。

1.7 数据分析和统计

使用QIIME管道分析原始的焦磷酸测序读数，以去除低质量的读数，并从序列读数中去除接头，条形码和引物。对每个样品分别进行反硝化细菌序列的分类学分类(OTU)。使用UPARSE软件(version7.1, http:∥drive5.com/uparse/)，根据97%的相似度下进行OTU聚类[23]。使用RDP classifier(http:∥rdp.cme.msu.edu/)注释每个OTU的代表性序列。比对Silva(Release115, http:∥www.arb-silva.de)数据库，设置比对阈值为70%[27]。

利用美吉的I-Sanger生信云平台(https:∥www.i-sanger.com/)进行α-多样分析(包括Shannon，Chao1和OTUs等指数)、Heatmap分析和冗余分析[23]。使用SPSS 21软件进行单因素方差分析(LSD法，p<0.05)和Pearson相关性分析。使用Origin Pro 9.0软件进行作图。图表中数据为3个重复的平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 长期施肥对土壤N2O累积排放量和土壤性质的影响

注：不同字母表示5%水平上差异显著(p<0.05)。

表1 不同施肥处理土壤性质

2.2 长期施肥对土壤nirS基因丰度、nirS型反硝化细菌的α-多样性和群落结构的影响

每克干土的nirS基因丰度为7.28×106～11.79×106个。与CK相比，所有施肥处理的nirS基因丰度无显著变化。所有施肥处理的nirS型反硝化细菌群落的Shannon指数与CK均无显著差异，但NK显著高于NPK。相比CK，NK显著提高了Chao1指数，而其他处理间没有显著差异。NK测得的OUT数量最高达420个，且显著高于CK和NPK。所有处理土壤nirS型反硝化细菌物种数(species)无显著差异(表2)。

表2 不同施肥处理土壤的nirS基因丰度和细菌α-多样性

不同施肥处理土壤nirS型反硝化细菌种水平的分布比例(将相对丰度<1%的部分合并为others)见图2，丰富度最高的4个优势种为unclassified_k_norank_d_Bacteria，Uncultured_bacterium_2303，unclassified_p_Proteobacteria和Rhodanobacter_sp._D206a。unclassified_k_norank_d_Bacteria的相对丰度，CK，N和NK差异不显著，但均显著高于NPK处理。unclassified_p_Proteobacteria的相对丰度，CK，N和NK差异不显著，其中CK和N显著高于NPK。uncultured_bacterium_2303的相对丰度NPK最高，显著高于CK和N。Rhodanobacter_sp._D206a的相对丰度，CK，N和NK差异不显著，但均显著低于NPK。CK和N的nirS型反硝化细菌群落结构组成最接近，其次是NK，而与NPK差别较大(图2)。

图2 不同施肥处理土壤nirS型反硝化细菌种水平相对丰度和聚类分析结果

2.3 N2O累积排放量、nirS型反硝化细菌群落和土壤性质之间的关系

SOC，AP和TN含量对土壤nirS型反硝化细菌群落结构组成具有显著影响(p<0.05)，而土壤pH具有极显著影响(p<0.01)。uncultured_bacterium_2303和Rhodanobacter_sp._D206a的相对丰度与SOC，AP和TN含量极显著正相关，而unclassified_p_Proteobacteria和unclassified_k_norank_d_Bacteria呈显著负相关。uncultured_bacterium_2303和uncultured_bacterium_888的相对丰度与土壤pH值极显著负相关，而unclassified_p_Proteobacteria和unclassified_k_norank_d_Bacteria呈极显著正相关(图3)。

3 讨 论

注：所有的排序轴由蒙特卡罗算法检验，*代表环境因子与群落结构在0.05水平上显著相关，**代表在0.01水平上极显著相关。

许多研究表明，N2O排放量与nirS基因丰度(多度)呈正相关[13,31]。本研究中，Pearson相关分析表明，EN2O与nirS基因丰度之间的相关系数为0.057，相关性不显著。这表明长期不同化肥施用下土nirS基因丰度对土壤N2O排放并没有显著影响。nirS基因丰度仅代表nirS型反硝化细菌的数量，而不能代表nirS基因的表达以及亚硝酸盐还原酶的活性，并且极易受外界环境的影响而发生变化。本研究中，长期施用化肥对土nirS型反硝化细菌丰度并没有显著影响(表2)，黑土、灌淤土和黑垆土上进行的长期施肥试验结果也同样表明，长期施氮磷钾化肥对土壤nirS基因丰度没有显著影响[5,16,32]。可见，旱作雨养条件下，长期施肥后土N2O累积排放量的变化并不能通过nirS型反硝化细菌丰度的变化来解释。

对比不施肥处理，长期施肥对土壤nirS型反硝化细菌α-多样性无显著影响，但是长期施NK肥显著高于长期施NPK肥(表2)。相较于NK处理，NPK处理的nirS型反硝化细菌的群落结构发生改变，部分优势种(uncultured_bacterium_2303和Rhodanobacter_sp._D206a)的相对丰度显著提高，未找到分类信息细菌(unclassified_p_Proteobacteria和unclassified_k_norank_d_Bacteria)的相对丰度显著降低，这可能导致了nirS细菌群落α-多样性的降低(图2和表2)。此外，NPK处理的OTUs指数和物种数量(species)较NK少也说明了这一点(表2)。长期施肥对土壤nirS型反硝化细菌α-多样性的影响可能与施用磷肥有关。有研究表明，土壤磷含量较高会降低土壤微生物的α-多样性[33]。由于长期施用磷肥，NPK的土壤有效磷含量达到了26.6 mg/kg，显著高于不施肥处理和不施磷处理(表1)。本研究中，通过Pearson相关分析表明，EN2O与反映nirS型反硝化细菌α-多样性的Shannon指数、Chao1指数、OTUs指数和物种数之间的相关系数分别为-0.299，0.248，-0.004和-0.069，均没有显著相关性。这表明长期不同化肥施用下土nirS型反硝化细菌多样性对土壤N2O排放也没有显著影响。因此，nirS型反硝化细菌群落α-多样性亦不是影响长期施肥后土N2O累积排放量的关键因素。

越来越多的研究表明，对N2O排放起关键作用的是nirS型反硝化细菌中的某些优势菌，比如Rhodanobacter，Azospirillum，Bradyrhizobium和Paracoccus等[3,34]。雨养旱作条件下，土nirS型反硝化细菌的主要优势种为uncultured_bacterium_2303，Rhodanobacter_sp._D206a，unclassified_p_Proteobacteria和unclassified_k_norank_d_Bacteria(图2)。长期不同化肥施用导致土的nirS型反硝化细菌群落结构组成产生了显著差异，其中长期平衡施用化肥提高了uncultured_bacterium_2303和Rhodanobacter_sp._D206a的相对丰度，降低了unclassified_p_Proteobacteria和unclassified_k_norank_d_Bacteria的相对丰度；而长期非平衡施肥(N和NK)对unclassified_p_Proteobacteria，unclassified_k_norank_d_Bacteria和Rhodanobacter_sp._D206a的相对丰度没有显著影响(图2)。冗余分析进一步表明，nirS型反硝化细菌群落结构组成对N2O排放的影响与关键优势种的相对丰度有关。EN2O与uncultured_bacterium_2303和Rhodanobacter_sp._D206a相对丰度显著正相关，而与unclassified_p_Proteobacteria和unclassified_k_norank_d_Bacteria的相对丰度显著负相关(图3)。因此，雨养旱作条件下，长期施肥改变了土nirS型反硝化细菌的群落结构组成,从而影响了N2O排放。

土壤SOC能够通过矿化作用间接为反硝化细菌提供电子供体，从而可以促进反硝化作用；土壤pH值会影响nirS型反硝化细菌的生长环境，而AP提高可以为nirS型细菌生长代谢提供所需要的磷素营养[35]。许多研究表明，长期不同施肥方式导致nirS型细菌群落结构组成发生改变的主要原因是长期施肥导致的SOC，TN，全磷和pH值等土壤因子的改变[36-37]。本研究中，长期非平衡施肥与不施肥处理土壤性质较接近，而长期平衡施用化肥显著提高了SOC，TN和AP，并降低了土壤pH值(表1)。相较于其他处理，长期平衡施用NPK化肥后土壤nirS型细菌优势种中的uncultured_bacterium_2303和Rhodanobacter_sp._D206a的相对丰度显著增加，而unclassified_k_norank_d_Bacteria和unclassified_p_Proteobacteria的相对丰度显著下降(图2)。冗余分析也表明，SOC，AP，TN和pH值等土壤性质是影响nirS型细菌群落结构组成的主要环境因素(图3)。

4 结 论