反相液相色谱法测定雷替曲塞中对映异构体

吴晶，王足兵，柴雨柱

反相液相色谱法测定雷替曲塞中对映异构体

吴晶，王足兵，柴雨柱

（南京正大天晴制药有限公司，江苏 南京 210046）

目的：建立雷替曲塞对映异构体检测方法。方法：采用Daicel CHIRALPAK AGP（3.0 mm×150 mm，5 μm）为色谱柱；以0.05 mol·L-1的磷酸氢二钠溶液（称取十二水合磷酸氢二钠17.9 g，加水1 000 mL使溶解，摇匀，用10%磷酸调pH值至6.5，搅拌均匀，即得）-异丙醇（98∶2）为流动相，等度洗脱；流速为0.5 mL·min-1，检测波长为226 nm。结果：专属性良好，对映异构体在限度质量分数20%～200%范围内线性关系良好，≥0.999 7；回收率在105.5%～106.9%范围内，RSD小于2.0%（=9）；精密度和重复性RSD均小于2.0%；耐用性良好。结论：方法精密度好、准确度高，可用于本品的对映异构体检测。

雷替曲塞； 对映异构体； 高效液相色谱仪法（HPLC）

雷替曲塞主要用于治疗晚期结直肠癌，为抗代谢类叶酸类似物，通过细胞膜外还原型叶酸盐载体系转运到细胞内，并代谢形成多聚谷氨酸类化合物，在细胞内较长时间存在，可以起到特异性抑制胸苷酸合酶活性，减少脱氧核糖核酸的修复与合成所需要的脱氧三磷酸胸苷，抑制肿瘤细胞增殖的作用[1-3]。

雷替曲塞分子结构中存在一个手性中心，除雷替曲塞主成分外，只具有一个手性异构体，即对映异构体。雷替曲塞对映异构体没有药效作用，甚至有毒副作用，因此对对映异构体的分析控制极为重要[4-5]。现有技术主要通过正相液相色谱法和毛细管电泳法两种方法检测雷替曲塞及其制剂中的对映异构体，正相液相色谱法使用正己烷和异丙醇为洗脱溶剂，气味难闻，保留时间容易漂移；毛细管电泳法重现性差，不适合用于药品质量控制。本文建立了以反相液相色谱法测定雷替曲塞原料药中光学异构体的方法，以期为该原料药质量控制提供依据[6-10]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司），色谱工作站：Agilent OpenLAB CDS；电子分析天平（瑞士METTLER公司）。

1.2 试药

供试品（雷替曲塞，南京正大天晴制药有限公司，批号：122161101），对照品（雷替曲塞对照品，南京正大天晴制药有限公司，批号：170101；对映异构体，南京正大天晴制药有限公司，批号：20161115），异丙醇、磷酸均为色谱级，磷酸二氢钾为分析纯，水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Daicel CHIRALPAK AGP（3.0 mm×150 mm，5 μm）；流动相：0.05 mol·L-1的磷酸氢二钠溶液 （称取十二水合磷酸氢二钠17.9 g，加水1 000 mL使溶解，摇匀，用10%磷酸调pH值至6.5，搅拌均匀，即得）-异丙醇（98∶2），等度洗脱；流速：0.5 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：10 µL。

2.2 溶液的制备

空白溶剂：0.05 mol·L-1的磷酸氢二钠溶液-异丙醇（98∶2）。

对映异构体对照品贮备液：取对映异构体适量，用溶剂溶解并稀释制成每1 mL中约含对映异构体125mg的溶液。

对映异构体对照品溶液：精密量取对映异构体对照品贮备液适量，用溶剂溶解并稀释制成每1 mL中约含对映异构体1.25mg的溶液。

供试品溶液：取雷替曲塞适量，用溶剂溶解并稀释制成每1 mL中约含雷替曲塞250mg的溶液。

系统适用性溶液：取雷替曲塞适量及对映异构体对照品适量，用溶剂溶解并稀释制成每1 mL含雷替曲塞250mg，含对映异构体1.25mg的溶液。系统适用性溶液：取雷替曲塞适量及对映异构体对照品适量，用溶剂溶解并稀释制成每1 mL含雷替曲塞250mg，含对映异构体1.25mg的溶液。

2.3 专属性

精密量取空白溶剂、系统适用性溶液、对照品溶液及供试品溶液各10mL，注入液相色谱仪，记录色谱图。空白溶剂对对映异构体的检测无干扰，主峰与对映异构体的分离度大于1.5，见图1-4，该方法的专属性良好。

图1 空白溶剂色谱图

图2 对映异构体对照品溶液色谱图

图3 供试品溶液色谱图

图4 系统适用性溶液色谱图

2.4 线性关系

取对映异构体对照品贮备液，用溶剂配制成相当于限度质量分数20%～200%的线性系列溶液。精密量取上述系列浓度溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，进行线性回归分析。回归方程为= 1.395 3×106+2.366 8×103，=0.999 7，表明对映异构体在限度质量分数20%～200%范围内，具有良好的线性关系。

2.5 检测限与定量限

取对映异构体贮备液适量，逐级稀释，当对映异构体色谱峰的信噪比不小于10时，该溶液作为定量限溶液；当对映异构体色谱峰的信噪比不小于3时，该溶液作为检测限溶液。分别精密量取溶液

10 μL进样分析，对映异构体的检测限质量浓度为12.8 ng·mL-1,相当于供试品质量分数的0.005%；定量限质量浓度为38.4 ng·mL-1,相当于供试品质量浓度的0.02%，该方法灵敏度良好。

2.6 回收率

取本品细粉适量，平行9份，平均分成3组，加入对映异构体对照品贮备液各适量，使供试品溶液中含对映异构体分别为限度质量分数的80%、100%及120%。按外标法计算对映异构体的含量，计算回收率，回收率在105.5.0%～106.9%，RSD均小于2.0%（=9），该方法的准确度良好。

2.7 重复性

平行配制6份加标供试品溶液，按外标法计算6份供试品溶液中对映异构体的含量，平均质量分数为0.50%，RSD为1.5%（=6），该方法的重复性良好。

2.8 中间精密度

不同人员，不同时间使用不同设备，按照重复性检测方法进行检测，结合6份重复性结果，计算12份加标供试品溶液中对映异构体的含量，含量RSD为1.9%（=12）；该方法的中间精密度良好。

2.9 溶液稳定性

取系统适用性溶液分别于配制结束后室温放置0、2、4、6、8和12 h进样。考察12 h内光学异构体保留时间、峰面积和含量的变化情况。结果显示光学异构体与雷替曲塞保留时间及峰面积无明显变化，光学异构体含量基本不变，溶液在12 h内稳定。

2.10 耐用性

适当调整色谱条件参数（流动相比例、流动相pH值、流速），系统适用性溶液主峰与对映异构体分离度均大于1.5，供试品中对映异构体结果基本一致，可见方法耐用性良好。

2.11 样品测定

取多批雷替曲塞原料药，按照上述验证后的对映异构体检测方法对其对映异构体进行检测。检测结果显示，我司各批次雷替曲塞原料对映异构体检测结果均符合限度要求。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

雷替曲塞及其对映异构体均在226 nm波长处均有较强吸收，选择226 nm作为本品对映异构体的检测波长。

3.2 色谱柱的选择

大赛璐（Daicel）CHIRALPAK AGP为蛋白质键合型手性柱，硅胶表面共价键合有α1-酸性糖蛋白，具有极强的手性识别能力，适用于反相系统。因此选择此色谱柱进行试验。

4 结 论

本研究中雷替曲塞对映异构体检测能达到理想的分离效果，对方法的专属性、灵敏度、精密度和耐用性进行了评价。该方法简便、准确，可用于雷替曲塞对映异构体检测，为合格的雷替曲塞的生产提供了有效的质控方法。

[1]黄荣华. 马爱霞. 雷替曲塞治疗结直肠癌的研究进展[J].中国药物评价,2014，31(1):14-16.

[2]彭登付，王勇，胡冰. 雷替曲塞治疗结直肠癌的临床应用[J]. 国际肿瘤学杂志,2013，40(12):933-935.

[3] KELLY C, BHUVA N, HARRISON M, et al. Use of raltitrexed as an alternative to 5-fluorouracil and capecitabine in cancer patients with cardiac history [J]., 2013, 49(10):2303-2310.

[4]张秋佳，陈雷，邹德超，等. HPLC法测定西他沙星异构体[J]. 中国抗生素杂志，2012,37(3):237-239.

[5]戴蓉,徐家根,刁岩忠. 改进HPLC法测定雷替曲塞原料药中光学异构体[J]. 中国药房,2017,28(30):4295-4297.

[6]夏平,邹春阳,孟祥军. 双氯芬酸钾软胶囊有关物质检测[J]. 辽宁化工,2018,47(3):204-206.

[7]赵迎春,韩继永. HPLC法测定卡巴他赛的有关物质[J]. 辽宁化工,2017,46(12):1225-1228.

[8]周波,邹春阳,庞小琳,等. HPLC法测定双氯芬酸钾中有关物质[J]. 辽宁化工,2012,41(3):322-324.

[9]王凤秋,邹春阳,孟祥军. HPLC法测定阿莫西林钠克拉维酸钾有关物质[J]. 辽宁化工,2012,41(5):537-538.

Determination of Enantiomers in Retitracin by RP-HPLC

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（Nanjing Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Co., Ltd., Nanjing Jiangsu 210046, China）

A method for the determination of the enantiomers of raltitrexed was established. Daicel CHIRALPAK AGP (3.0mm×150mm, 5μm) was used as chromatographic column,0.05mol·L-1disodium hydrogen phosphate solution (weighing 17.9g disodium hydrogen phosphate dodecahydrate, adding 1000mL water to dissolve, shake well, adjusting the pH value to 6.5 with 10% phosphoric acid, and stirring well)-isopropanol (98∶2) was used as mobile phase to elute equally, the flow rate was 0.5mL·min-1and the detection wavelength was 226nm. The results showed that the specificity of the method was good, and the linear relationship between enantiomers was good in the mass fraction range of 20%～200%,≥ 0.9997, the recovery was in the range of 105.5%～106.9%,was less than 2.0% (= 9), and precision and repeatabilitywas less than 2.0%.So,the method has good precision and high accuracy, and can be used for the determination of enantiomers of this product.

Retitracin; Enantiomer; High performance liquid chromatography (HPLC)

O657.7

A

1004-0935（2022）02-0291-03

2021-10-21

吴晶（1986-），男，浙江金华人，工程师，硕士学位，2012年毕业于中国药科大学药学化学专业，研究方向：创新药及仿制药研发。

柴雨柱（1976-），男，工程师，硕士学位，研究方向：药物研发。