猪乙型脑炎病的诊断与防控

邵攀峰 孙庆霞 李少丽 朱国坡 尹忠良

杭州佑本动物疫苗有限公司，杭州310018

猪乙型脑炎是一种人畜共患病，是由乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一种急性、发热性传染病。JEV 在分类上属于黄病毒科（Flaviviridae)黄病毒属[1-3]，病毒粒子呈球形，20 面体对称，有囊膜、单股、正链RNA。该病在不同的地域季节性发病差异显著，在热带地区没有明显的季节性，而在温带和亚热带地区发病则有严格的季节性[4]。因此，该病对养猪业的健康发展具有极大的危害性，给我国乃至全球的养猪业造成了巨大的经济损失，制约了养猪业的快速健康发展。

1 流行病学调查

2021年7月，某养猪场先后有6 头妊娠母猪流产，流产比例明显超出日常正常情况，发病母猪表现精神不振，食欲减退，饮水增加，粪便发干呈球状，尿液呈深黄色。有2 头公猪表现一侧睾丸肿胀；个别小猪有站立不稳、转圈运动、全身抽搐等症状，有的突然倒地死亡。调查发现，该养殖场属于家庭农场，主要采取自繁自养模式饲养，共养猪200 多头，其中母猪42 头，近3年来未从外面引种。养殖场周围无养猪场和村庄，但是养殖场大门口附近有一条公路来往车辆较多。该养猪场仅进行猪瘟疫苗和猪口蹄疫疫苗的免疫接种，其他疫病疫苗从未接种过。由于前段时间本地区连续强降雨，造成养殖场周围有多处大小不等积水坑，近期积水坑和养猪场出现比往常较多的蚊虫。

2 临床症状

本病主要的临床症状是妊娠母猪流产，病猪伴有体温升高，呈稽留热型，体温40～42 ℃，但也有母猪仅表现流产，没有其他任何临床症状。流产胎儿多为木乃伊胎或死胎，体表表现水肿或发红。临近预产期母猪流产胎儿，有些虽然有呼吸，但体质很弱，大多经1～3 d 死亡；个别流产胎儿也有表现正常，并且生长状况较好。刚出生仔猪发病后表现为站立不稳、走路摇摆、全身抽搐等发病症状，患病仔猪1 周内大多死亡。母猪流产后多表现胎衣不下或滞留，易诱发母猪子宫内膜炎。公猪表现为体温升高、一侧睾丸肿胀。

3 病理变化

妊娠母猪流产胎儿主要表现全身肌肉颜色变浅，如水煮肉样褪色，淋巴结点状出血，脑和脊髓膜充血、出血，胎膜充血并散在点状出血。发病仔猪可见脑水肿，浆膜有点状出血、淋巴结出血、肝脏和脾有坏死灶等。流产母猪子宫内膜表现水肿、充血或者小点状出血，且有较多黏稠分泌物覆在黏膜上。公猪表现为睾丸肿胀，睾丸切面存在大小不等黄色坏死病灶，且周围伴有出血、充血。

4 实验室检测

4.1 细菌分离培养

采集病死猪的脑、心、肝分别涂片、触片镜检并接种鲜血琼脂、普通琼脂、营养肉汤和厌氧肉汤培养基，在恒温培养箱中37 ℃培养48 h 观察，结果均为阴性。

4.2 猪布氏杆菌病检测

由于猪布氏杆菌病在临床症状和病理变化也会出现相似症状，利用布鲁氏菌病虎红平板凝集试验，对采集的13 份被检猪血清进行检测，结果表明，阳性对照血清出现肉眼可见的凝集现象，阴性对照血清无凝集现象成均匀粉红色，检测13 份猪血清样品结果均为阴性。

4.3 病原PCR 检测

根据GenBank 收录的乙型脑炎病毒基因序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计1 对引物（上游引 物JEV-P1:5′-ATGGATTGTCTGGGAATGGGCA ATCG-3′；下游引物JEV-P2:5′-GCTATGCACATTGGTCGCTAAG-3′）扩增乙型脑炎病毒，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，上、下游引物之间预期扩增片段长463 bp。

将预先称重的组织样品剪碎，研磨成糊状，加入2 倍组织重量的无菌PBS 溶液，震荡混匀，-80 ℃反复冻融3 次，4 ℃、3 500 r/min 离心10 min，取上清备用。按照病毒RNA/DNA 提取试剂盒的方法对组织上清进行总RNA 的提取。

以总RNA 为模板，采用1st Strand cDNA 试剂盒制备cDNA。在反应管中配制以下试剂（50 μL）：Random 6 mers 2.5 μL，dNTP Mixture 2.5 μL，RNase Free H2O 10 μL，模板10 μL；65 ℃保5 min后，冰上冷却；向管中再加入5×PrimeScript ⅡBuffer 10 μL，RNase Inhibitor 1.3 μL，PrimeScriptⅡRTase 2.5 μL，RNase Free H2O 11.2 μL；混匀，30 ℃10 min，45 ℃60 min，70 ℃15 min，冰上冷却，即为cDNA 模板。

以cDNA 为模板，利用JEV 引物扩增。反应体系如下（20 μL）：10×Ex Taq buffer 2 μL，dNTP Mix 1.6 μL，JEV-P1 0.8 μL，JEV-P2 0.8 μL，Ex Taq 0.16 μL，ddH2O 12.64 μL，cDNA 2 μL。PCR 反应程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s，35 个循环；72 ℃10 min。

取PCR 扩增产物5 μL 检测，经1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像仪下观察检测扩增条带检测结果。结果表明，10 份样品进行乙型脑炎病毒RT-PCR 检测，有4 份样品扩增出明显条带，有3 份样品扩增条带亮度微弱，扩增出目的条带大小相符（463 bp），而阴性对照无条带（图1）。

图1 猪乙型脑炎病毒RT-PCR 结果

4.4 病毒分离培养

当BHK-21 细胞生长致密细胞单层，弃去生长液，将猪乙型脑炎病毒RT-PCR 检测为阳性的组织样品或细胞培养物按1.5%比例接种病毒液，35 ℃吸附60 min，加入维持液，置35 ℃，5% CO2培养。在显微镜下观察BHK-21 细胞CPE，培养至72 h或细胞病变达80%左右时将培养物反复冻融3 次收获，连续继代培养，观察乙脑病毒对BHK-21 细胞的适应性。结果表明，4 份RT-PCR 检测猪乙型脑炎病毒阳性的病料组织样品，经过接种BHK-21 细胞连续继代培养，显微镜下观察BHK-21 细胞病变，3 份病料组织样品不能引起BHK-21 细胞病变；有1 份病料组织样品能引起BHK-21 细胞明显而稳定的细胞病变。

4.5 病毒含量测定

将病毒液用DMEM 液作10 倍系列稀释，取10-1～10-7稀释度，每个稀释度接种6 孔至长满BHK-21 细胞单层的96 孔细胞培养板，每孔接种量为0.1 mL，同时设立DMEM 液阴性对照孔，置37 ℃，5% CO2培养至120 h，观察细胞病变，按Reed-Muench 法计算病毒液TCID50。将病毒液系列稀释，接种至长满BHK-21 细胞致密单层的96 孔细胞培养板，37 ℃，5% CO2培养120 h，根据细胞病变孔数量，按Reed-Muench 法计算病毒液每毫升病毒液中的TCID50，结果表明，病毒含量可达到107.3 TCID50/mL。

4.6 病毒中和试验

选已测出病毒含量的病毒液用含2%新生牛血清的DMEM 培养液稀释至200 TCID50/0.1 mL，与等量乙型脑炎病毒阳性血清混合后，置37 ℃中和60 min，接种6 孔细胞培养板上已长成良好单层的BHK-21 细胞4 孔，0.4 mL/孔；同时设病毒对照孔4孔，每孔接种同条件处理的病毒与含2%新生牛血清的DMEM 培养液混合液0.4 mL；正常细胞对照孔4 孔，每孔加入含2%新生牛血清的DMEM 培养液0.4 mL，置37 ℃、5% CO2条件下培养5 d，观察CPE。结果表明，JEV 病毒对照孔4/4 细胞出现CPE；JEV 与乙型脑炎病毒阳性血清中和均未出现CPE 孔；正常细胞对照孔4/4 未出现CPE，表明JEV能够被乙型脑炎病毒阳性血清特异性中和。

5 诊 断

结合流行病学调查、临床发病症状、病理剖检变化和实验室病原PCR 检测、病毒分离培养、病毒含量测定、病毒中和等试验方法进行综合诊断，确诊该养猪场发生的疫病为猪乙型脑炎病。

6 综合防控

6.1 加强饲养管理

目前该病没有特效治疗药物，通过焚烧或深埋等方式对母猪流产分泌物、胎衣及流产胎儿及时做好无害化处理。健康猪群提供充足清洁饮水，营养全面饲料，并在饲料或饮水中添加复合多维，提高猪群整体抗病能力。对有发热症状的病猪，肌肉注射安乃近注射液10～20 mL，2 次/d，直到体温恢复正常。同时，可肌肉注射磺胺嘧啶注射液20 mL，防止继发感染，2 次/d，连用3 d。

6.2 疫苗接种

在生产中，猪乙型脑炎病毒的主要传播途径是通过蚊虫叮咬，因此，做好该病的预防措施，注射疫苗显得尤为重要[5]。对猪群进行猪乙型脑炎活疫苗（SA14-14-2 株）紧急免疫接种，首免14 d 后再加强免疫1 次，建议以后每年4月和10月各普免1次猪乙型脑炎疫苗。